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1、1辛伐他汀对压力超负荷大鼠 APN、IL6 及心肌肥厚影响【摘要】 目的 观察辛伐他汀对压力超负荷大鼠血清脂联素（APN） 、白细胞介素6 （IL6 ）水平以及心肌肥厚的影响，探讨该类药物影响心肌肥厚可能的作用机制。方法 实验动物随机分对照组、心肌肥厚组、治疗组，每组 10 只。应用经典的腹主动脉结扎方法，制备压力超负荷大鼠模型。治疗组大鼠给予辛伐他汀 5 mg/kg 每日清晨灌胃，连续 6 周。心肌肥厚组和对照组同时以同等剂量的 9 g/L的氯化钠溶液每日清晨灌胃，直至术后 6 周。采用鼠尾测压法测定大鼠血压的变化；酶联免疫吸附试验法检测大鼠血清 APN、IL6浓度。实时定量 PCR 检测心
2、肌组织中 IL6、脂联素受体1(AdipoR1)的 mRNA 表达。称量法计算各组大鼠心脏质量及心脏质量/体质量比值，并观察心肌的病理学改变。结果 心肌肥厚组大鼠血清 APN 水平、IL6 水平、心脏质量、心脏质量/体质量比值、左心室壁平均厚度、心肌细胞平均直径，以及心肌 IL6、AdipoR1 mRNA 表达与对照组相比差异有显著性（q=3.41 31.83,P0.01） 。治疗组大鼠与心肌肥厚组相比血清APN 水平、 IL6 水平、心脏质量、心脏质量/体质量比值、左心室壁平均厚度、心肌细胞平均直径以及心肌 IL6、AdipoR1 mRNA表达差异有显著性（F=3.57329.93,q=3.
3、1131.08，P0.01） 。结论 辛伐他汀可能通过增加血清 APN 的浓度以及心肌细胞因子的2表达来抑制压力负荷增加引起的大鼠心肌肥厚。 【关键词】 心室重构；辛伐他汀；脂联素；白细胞介素 6；大鼠,Wistar 脂联素（APN ）是由脂肪细胞分泌的一种特异性蛋白，与肥胖、胰岛素抵抗、糖尿病等病理改变有关。近年来发现它对心血管系统具有保护作用，但与高血压及其所致的心脏损害的关系尚不十分清楚。细胞因子在高血压等压力负荷增加引起心肌肥厚的过程中发挥着一定作用，这些因子在心肌中的表达水平可能与心肌肥厚密切相关。他汀类药物为 3羟3 甲基戊二酰辅酶 A 还原酶(HMGCoA) 抑制剂，除了降低胆固
4、醇外，还具有“多效应作用”1，在改善心肌肥厚中的应用还处于探索阶段。本研究将辛伐他汀应用于大鼠心肌肥厚的动物模型，观察大鼠用药后心肌的病理改变以及血清 APN 水平、心肌细胞因子表达的变化，探讨辛伐他汀对心肌肥厚的影响及可能的作用机制，旨在为心肌肥厚的预防和治疗提供新的手段和方法。现将结果报告如下。 1 材料和方法 1.1 动物及分组 SPF 级 Wistar 雄性大鼠 30 只，体质量 200220 g,由我院实验动物中心提供。随机分成 3 组：对照组、心肌肥厚组及治疗组。每组均为 10 只。 1.2 动物模型制备及各组处理 3实验前各组大鼠均在实验室喂养 1 周，测定其基础血压。参照文献2
5、的方法制备腹主动脉缩窄型大鼠心肌肥厚模型，大鼠经100 g/L 的水合氯醛（0.3 mL/kg）腹腔麻醉后行剑突下正中切口，于双侧肾动脉分支近心端处将腹主动脉与七号针头结扎在一起后，抽出针头，脏器恢复原位，缝合切口。对照组只实行相同的手术程序，不结扎腹主动脉。术后 3 d 大鼠恢复后，从尾动脉测定收缩压，连续观察血压的变化。心肌肥厚模型选取术后 2 周血压维持在21.33 kPa 以上的大鼠用于实验。术后 2 周治疗组大鼠给予辛伐他汀（由默沙东制药有限公司提供）5 mg/kg 每日清晨灌胃，连续 6周。心肌肥厚组和对照组同时以同等剂量的 9 g/L 的氯化钠溶液每日清晨灌胃，直至术后 6 周。
6、 1.3 取材 处死动物前称体质量，处死后取心脏称质量，计算心脏质量/体质量比值。在距心尖与心底等距离处横行切断心脏，心底端置 40 g/L 的甲醛溶液固定，进行病理学实验；心尖端置液氮保存，进行分子生物学实验。 1.4 大鼠血清 APN、白细胞介素6 （IL6 ）浓度检测 采用酶联免疫吸附实验法（ELISA ） ，实验方法参照试剂所提供操作指南，结果在全自动酶标仪上进行比色分析。 41.5 实时定量 RTPCR 检测心肌细胞脂联素受体 1(AdipoR1)、IL6 的 mRNA 的表达 取冻存心肌组织约 100 mg，剪碎, 用 Trizol 试剂 1 000 mL提取总 RNA (具体步骤
7、参见试剂说明书)。应用引物 Oligod (T) 18 和 Random 逆转录合成 cDNA。配置 PCR 体系，应用 SYBR Green荧光染料技术扩增待测基因及内参基因所用引物。见表1。反应条件：第一次循环 95 10 s；然后以 95 5 s,60 50 s,进行 40 次循环；最后进行溶解曲线分析。以阴性对照 GAPDH 作为参考，计算机分析 Ct 值，即每个反应管内荧光强度达到系统认为的有目的 DNA 合成时的循环数，用以评定各因子 mRNA 的实时定量相对表达水平。以上试剂及引物均由宝生物工程(大连) 有限公司提供。 1.6 病理学检测 将甲醛固定的心脏组织做成石蜡切片，经苏木
8、精 伊红染色后拍照，用 ImagePlus 图像分析软件测量左心室前壁、侧壁、后壁和室间隔的厚度，并取平均值即为左心室壁的平均厚度；在显微镜下放大 40 倍后再拍照，每张切片随机选取 10 个视野，每个视野选 10 个细胞，用 ImagePro Plus 软件测每个细胞的面积，取平均值后计算出其等效面积圆的直径，即为心肌细胞平均直径。 1.7 统计学处理 5实验结果以s 表示，采用 SPSS 11.5 统计软件进行单因素方差分析,两组间比较用 q 检验。 2 结果 2.1 各组大鼠血清脂联素、 IL6 水平的变化 腹主动脉结扎术后 8 周，心肌肥厚组大鼠血清脂联素、IL6水平与对照组比较差异有
9、显著性（F=33.55、87.63,q=11.23、18.66,P0.01） ；治疗组血清脂联素、IL6 水平与心肌肥厚组比较差异有显著性（q=5.62、 10.66,P0.01） 。见表 2。 2.2 辛伐他汀对大鼠心脏病理学改变的影响 3 组大鼠体质量比较差异无统计学意义。心肌肥厚组心脏质量、心脏质量/体质量比值、左心室壁平均厚度、心肌细胞平均直径与对照组比较差异有显著性（F=3.57329.93，q=3.4131.83,P0.01） 。治疗组心脏质量、心脏质量/体质量比值、左心室壁平均厚度、心肌细胞平均直径与心肌肥厚组比较差异有显著性（q=3.1131.08，P0.05） ；左心室壁平均
10、厚度、心肌细胞平均直径与对照组比较差异有极显著性(q=6.64、3.89，P0.01) 。见6表 3。 2.3 辛伐他汀对大鼠心肌 AdipoR1、IL6 mRNA 表达的影响 实时定量 PCR 结果显示，心肌肥厚组大鼠心肌中IL6、AdipoR1 mRNA 表达与对照组比较差异有显著性（F=19.73、56.45,q=8.89、13.44,P0.01） 。应用辛伐他汀治疗 6 周后大鼠 IL6、AdipoR1 mRNA 的表达与心肌肥厚组比较差异有显著性（q=4.44、12.54 ，P0.01） 。见表 4。 表 1 扩增待测基因及内参基因所用引物基因（略） 表 2 各组大鼠血清脂联素、IL
11、6 水平的变化（略） 表 3 辛伐他汀对大鼠心脏病理学改变影响（略） 表 4 辛伐他汀对大鼠心肌细胞因子 AdiptR1、IL6 mRNA表达的影响（略） 3 讨论 临床上高血压、心脏瓣膜病等压力负荷增加引起心肌肥厚，进而发展为心力衰竭较常见。近年来发现脂联素的缺乏与心肌肥厚有关。在脂联素缺乏的小鼠体内，压力超负荷导致心肌向心性肥厚与心肌细胞外信号调节激酶（ERK）增多和 AMP 激活的蛋白酶（AMPK）信号传递减少有关3。脂联素通过活化 AMPK 信号来调控缺血组织的血管生成4,在这一过程中存在着一条重要的信号传导7通路, 即脂联素AMPK 磷脂酰肌醇3 激酶(PI3K) 丝氨酸 苏氨酸蛋白
12、激酶(Akt) 一氧化氮合酶(NOS) 信号轴，在心肌培养中脂联素激活 AMPK，从而抑制心肌肥厚的信号传递。 IL6 是最具代表性的致炎症细胞因子，其分泌与 TNF 和 IL1 直接相关,IL6 及其相关细胞因子通过剌激其共同的 gp130 受体亚单位在心肌细胞的表达而影响心肌肥厚状况5。脂联素与炎性细胞因子的表达密切相关，脂联素可以通过调节 ERK 途径抑制 IL6 的表达。炎症递质如 TNF 和 IL6 水平增高均能抑制和减少脂联素在脂肪组织中的表达和分泌6。 研究表明，他汀类药物除了降低胆固醇，还可能通过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR) 信号转导通路影响脂联素水平，并通过核因子B
13、(NFB)、活化蛋白1 (AP1)等多种途径调控 IL6等炎性细胞因子的基因表达7,8。本研究结果表明，心肌肥厚组大鼠心肌细胞 IL6 表达增加，脂联素受体表达减少，血清脂联素水平下降，说明心肌细胞在病理状态下具有炎性细胞因子自分泌作用，且 IL6 和脂联素相互影响，这与国外报道的结果相一致。心肌肥厚大鼠给予辛伐他汀药物治疗后，与心肌肥厚组相比心肌细胞因子的表达减少，脂联素受体表达升高；血清脂联素水平上升，IL6 水平下降。同时，还能使大鼠心脏质量、心脏质量/体质量比值、左心室壁平均厚度和心肌细胞平均直径均降低。表明辛伐他汀能够在蛋白和转录水平改善 IL6、脂联素及其受体的表达，这可能是辛伐他
14、汀8抑制压力负荷增加引起左心室肥厚的作用之一。 综上所述，辛伐他汀可纠正脂联素和细胞因子失衡，改善心肌肥厚。此为他汀类药物的新用途提供了有益的实验资料。但是,他汀类药物改善心肌肥厚的作用及其临床价值还有待于深入研究。 【参考文献】 1WASSMANN S, RIBAUDO N, FAUL A, et al. Effect of atorvastatin 80 mg on endothelial cell function (forearm blood flow) in patients with pretreatment serum lowdensity lipoprotein cholest
15、erol levels 130 mg/dlJ. Cardiol, 2004,93:8488. 2蔡智荣,孙婷 . 心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡与依那普利干预治疗效果J. 青岛大学医学院学报 , 2004,40(2):305307. 3KUBOTA N, TERAUCHI Y, YAMAUCHI T, et al. Disruption of adidonectincauses insulin resistance and neointimal formationJ. J Biol Chem, 2002,277:2586325866. 4OUCHI N, KOBAYASHI H, KIHARA S, et al. Adiponectin stimulates angiogenesis by promoting crosstalk between AMPactivated protein kinase and Akt signaling in endothelial cellsJ. J Biol Chem, 2004,279:13041309. 95ORSHAL J M, KHALIL R A. Reduced endothelial NOCMPmediatedvascular relaxation and hypertension
