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1、2016 12 05 抗体的生产制备 4 2 2020 2 特异性抗体的制备与纯化技术 多克隆抗体 抗血清 单克隆抗体 杂交瘤技术 单克隆抗体与多克隆抗体 4 2 2020 3 4 2 2020 4 抗体发展史 抗体制备技术主要经历了三代 第一代抗体是传统的抗体制备方法即利用抗原免疫动物后获得抗体 称为多克隆抗体 polyclonalantibody 第二代抗体是通过杂交瘤技术制备出针对抗原中某一抗原决定簇的抗体称为单克隆抗体 monoclonalantibody McAb 第三代抗体是利用基因工程技术制备而来 称为基因工程抗体 geneticengineeringantibody 第一节多克
2、隆抗体的制备与纯化 4 2 2020 5 克隆 clone 是指无性繁殖细胞系 是由单一个祖先细胞分裂繁殖而形成的一簇细胞纯系 在这个家族的所有成员中 如无突变发生 其基因是完全相同的 多克隆抗体 polyclonalantibody pAb 用一种包含多种抗原决定簇的抗原免疫细胞 可刺激多个B细胞克隆产生针对多个抗原表位的不同抗体 多获得的免疫血清实际上是含有多种抗体的混合物 即多克隆抗体 单克隆抗体 monoclonalantibody mAb 由一个识别一种抗原表位的B细胞克隆产生的同源抗体 高度均一 特异性强 效价高 少或无交叉反应性 4 2 2020 6 多克隆抗体 抗血清 的制备流
3、程 4 2 2020 7 一 抗原的制备 二 免疫动物 三 免疫血清的收集 分离和保存 四 抗体的纯化 五 免疫血清的鉴定 六 免疫失败的可能原因及应采取的措施 4 2 2020 8 一 抗原的制备 免疫原 immunogen 指能刺激机体免疫系统产生特异性抗体或致敏淋巴细胞 抗原最重要的性质是免疫原性 immunogenicity 免疫原 天然抗原 人工合成抗原 蛋白质 多糖 脂类 核酸抗原 免疫原的分类 一 细胞性抗原制备 绵羊红细胞 SRBC 溶血素 细菌 抗菌抗体 动物免疫血清 二 可溶性抗原制备 指蛋白质 多糖和脂类等 4 2 2020 9 细胞性抗原 主要包括人 动物的细胞 还有细
4、菌 螺旋体及寄生虫等 如菌体 O 抗原的制备 选择标准菌株 接种于斜面或平板培养基表面 置温箱37 培养24h 用适量的无菌生理盐水刮下菌苔 移入无菌含有玻璃珠的三角瓶中 充分摇匀菌体 100 水浴2 2 5h杀菌并破坏鞭毛抗原 取处理过的菌液 检测有无活菌的存在 合格后用无菌生理盐水稀释成每毫升8亿 10亿个细菌 加入苯酚 石炭酸 至最终浓度为5 即为O抗原 1 细胞性抗原或颗粒性抗原 2 可溶性抗原 4 2 2020 10 可溶性抗原主要包括蛋白质 糖蛋白 脂蛋白 脂多糖 酶 补体 细菌外毒素 核酸等 它们大多数来源组织细胞 成分复杂 制备这类抗原时 首先需将组织和细胞破碎 然后再从组织和
5、细胞匀浆中提取目的成分 提纯后的抗原需鉴定后才能用做免疫原 1 组织匀浆的制备 所有的组织必须是新鲜的或低温保存的 器官或组织获得后立即去除表面的包膜或结缔组织以及大血管 在4 水浴或冰浴中将洗净的组织剪成小块 加入适量生理盐水 装入捣碎机破碎制成组织匀浆 2 细胞破碎 提取细胞可溶性抗原 需将细胞破碎 常用方法有冷热交替法 超声破碎法 反复冻融法 自溶法和酶处理法等 3 蛋白提纯 4 2 2020 11 超速离心法 常用密度梯度介质有蔗糖 甘油 选择性沉淀法 盐析沉淀法 其原理是根据蛋白质理化特性的差异 采用各种沉淀剂或改变某些条件促使蛋白质抗原成分沉淀 从而达到纯化的目的 如选用33 50
6、 饱和度的硫酸胺收集沉淀物 4 2 2020 12 凝胶层析法 分子筛层析 蛋白质分子按大小被分离 离子交换层析 带电的生物大分子和离子交换色谱填料上的离子基团进行交换而被分离纯化 以离子交换剂为固定相 依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离 亲和层析 利用生物大分子的生物特异性如抗原抗体 激素受体 IgG和葡糖球菌蛋白A SPA 制备电泳技术 4 2 2020 13 其它 聚丙烯酰胺凝胶胶内蛋白可将抗原所在的电泳条带 或蛋白点 切下 研磨后直接用以动物免疫 NC膜结合蛋白将含目的分子的蛋白进行SDS PAGE电泳 转移至NC膜上 丽春红显色至清晰
7、显示目的条带 取目的条带置于加有PBS的1 5ml离心管中 用PBS洗至无色 继而剪碎 研磨 用于动物免疫 4 2 2020 14 分离纯化方法的比较 4 纯化抗原的鉴定 4 2 2020 15 含量测定 采用常规蛋白或糖类浓度测定法 一般采用分光光度计测量法 相对分子量的鉴定 一般采用SDS PAGE电泳法 纯度鉴定 常用区带电泳法鉴定 3 半抗原 4 2 2020 16 半抗原物质多数为低分子质量的物质 如 多糖 多肽 甾体激素 脂肪胺 类脂质 核酸 某些药物及其它化学药品 常用载体 蛋白质类如 牛血清白蛋白 人血清清蛋白 兔血清清蛋白等 多肽聚合物 如多聚Lys 赖氨酸 大分子聚合物 如
8、羟甲基纤维素 半抗原 载体连接方法 常用物理法和化学法 物理吸附的载体有羟甲基纤维素等 其借助电荷和微孔吸附半抗原 化学法则是利用某些功能基团把半抗原连接到载体上 4 2 2020 17 某些物质与抗原一起或先于抗原注入机体 可增强机体对该抗原的特异性免疫应答或改变免疫应答类型 此类物质称为免疫佐剂 immunoadjuvant 简称佐剂 四 免疫佐剂 良好的佐剂应当具备以下条件 增加抗原的表面积 并改变抗原的活性基团构型 从而增强抗原的免疫原性 佐剂与抗原混合能延长抗原在局部组织的存留时间 降低抗原的分解速度 使抗原缓慢释放至淋巴系统中 持续刺激机体产生高滴度的抗体 佐剂可以直接或间接激活免
9、疫活性细胞并使之增生 从而增强了体液免疫 具有无毒性或副作用低的特点 4 2 2020 18 佐剂一般包括以下几类 无机佐剂 如氢氧化铝 明钒等 生物性佐剂 如结核分枝杆菌 卡介苗 小棒状杆菌 百日咳杆菌 革兰阴性杆菌内毒素 霍乱毒素的B亚单位 胞壁酰二肽和细胞因子等 人工合成佐剂 如双链多聚肌苷酸 胞苷酸 polyI C 双链多聚腺苷酸 尿苷酸 polyA U 油剂 如弗氏完全佐剂 花生油乳剂等 纳米佐剂 1 佐剂的种类 4 2 2020 19 应用最多的是弗氏佐剂和细胞因子佐剂弗氏佐剂 不完全佐剂 液体石蜡 羊毛脂完全佐剂 液体石蜡 羊毛脂 卡介苗弗氏佐剂 抗原 1 1乳化成 油包水 乳液
10、 乳化方法主要有研磨法和注射器混合法 完全佐剂一般不连续2次使用细胞因子佐剂 IL 2IL 1IFNr 羊痘病毒 干扰素受体 CSF 集落刺激因子 等 4 2 2020 20 增强抗原免疫原性 使无或微弱免疫原性的物质变成持久或强的免疫原 增强机体对抗原刺激的反应性 提高初次应答和再次应答所产生的抗体滴度 改变抗体类型 使产生抗体由IgM型转变为IgG型 引起或增强迟发性超敏反应 2 佐剂的免疫生物学作用 4 2 2020 21 佐剂的作用机制归纳起来主要有如下几种 可增强抗原的表面积和改变抗原活性基团构型 从而增强抗原的免疫原性 佐剂与抗原混合一起注入机体 可改变抗原的物理性状 形成抗原储存
11、库 延长抗原在局部组织的滞留时间 有利于抗原的缓慢释放 增强吞噬细胞的吞噬作用 被佐剂吸附的抗原易被吞噬细胞吞噬 促进对抗原的处理 刺激淋巴细胞增生 从而增强和扩大免疫应答的效应 3 佐剂的作用机制 二 动物免疫 4 2 2020 22 选择动物时应考虑以下因素 抗原来源与动物种属的关系 抗原的来源与免疫动物种属差异越远 其免疫源性越强 免疫效果越好 而同种系或亲缘关系越近 免疫效果越差 动物个体的选择 适龄 健康 体重符合要求的正常动物 以雄性为佳 抗体需要量少时 选用家兔 豚鼠和鸡等小动物 抗体需要量大时 可选用绵羊 山羊 马 驴等大动物 一 免疫动物的选择 4 2 2020 23 选定动
12、物后 在免疫过程中应考虑免疫剂量 免疫途径 免疫次数 免疫间隔等因素 1 免疫原的剂量 免疫原的接种剂量按免疫原性的强弱 动物的个体状态和免疫时间来确定 首次免疫时 剂量不宜过大 以免产生免疫麻痹 二 免疫方法 免疫途径通常有皮内 皮下 肌肉 静脉 腹腔 淋巴结等 视不同的免疫方案而异 对于不易获取的宝贵抗原可采用淋巴结免疫法 免疫间隔时间是影响抗体产生的重要因素 其中首次与第二次免疫的间隔时间尤为重要 一般以10 20天为佳 二次后间隔时间一般为7 10天 若间隔时间太长 则刺激减弱 抗体效价不高 2 免疫途径与免疫间隔时间 4 2 2020 24 三 免疫血清的收集 1 采血前测抗体效价在
13、第2次加强免疫后2周 从兔耳缘静脉取2 3ml血 制备血清 检测抗体效价 如未达到预期效价 需再进行加强免疫 直到满意时为止 当抗体效价达到预期水平时 即可放血制备抗血清 抗血清的效价 就是指血清中所含抗体的浓度或含量 效价测定的方法常用的是放射免疫法 此法对所有的抗体均适用 某些由大分子 如蛋白类 抗原所产生的抗体 可用双向扩散等方法测定 前者测定的效价极为精确 而后者则粗糙得多 4 2 2020 25 放射免疫法 以不同稀释度的抗血清与优质标记抗原 放射性核素标记 混合 孵育24h后 测定其结合率 用液体闪烁计数仪测定Ag Ab或游离Ag 通常以结合率为50 的血清稀度为效价 如某抗血清的
14、结合率为50 时的稀释度为1 15000 则该血清的效价就是1 15000 抗血清的效价 除由抗血清本身的性质决定外 还受标记抗原的质量 孵育时间 所用稀释液的成分及其pH等因素的影响 在工作中必须引起注意 4 2 2020 26 双向扩散法 利用大分子抗原和抗体在琼脂平板上扩散 两者在相交处产生沉淀线 以观察和判断抗血清中是否有抗体及其浓度 琼脂板的制备 100mlpH7 1的磷酸盐缓冲液加到15g的琼脂内 于水浴中加温 搅拌 使琼脂完全溶解 趁热用纱布过滤 待溶液冷却到65 左右时 加入叠氮钠 NaN3 使其在溶液中的浓度为0 1 用移液管把琼脂放在干净平皿或玻片上 约3mm厚 待其冷却
15、完全凝固后 用打孔器打孔 中央孔内加适量抗原 容量为50 l 周围各孔内分别加入50 l1 2 1 4 1 8 1 16 1 32及不稀释的抗血清 37 下孵育24h 观察有无沉淀线产生 以判断血清的稀释度 2 抗血清的采集 4 2 2020 27 采集 颈动脉放血 心脏采血 静脉采血分离 室温自然凝固1 2h 然后放4 冰箱过夜 待血块收缩后分离血清 有些血清须经56 30min使补体灭活 保存 4 保存 存放3个月至半年低温保存 70 20 2至3年 忌反复冻融真空干燥保存 4 5年 注意 保存前需经除菌保存液含防腐剂避免反复冻融 分装 4 2 2020 28 四 抗体的纯化 1 目的 尽
16、量除去抗血清中与目的抗体不相关的成分2 纯化方法1 单价特异性抗血清的纯化单价特异性是指抗血清只与其特异性抗原发生反应 去除杂抗体主要方法 亲和层析法 将引起交叉反应的共同抗原交联到Sepharose4B柱上 把要处理的抗血清通过亲和层析柱 共同抗体吸附在柱上 洗脱液则含有特异性抗体 吸附法 指将非特异性抗原液与戊二醛制备成固相吸附剂按1 10直接加到免疫血清中去除杂抗体 2 特异性IgG类抗体的纯化 4 2 2020 29 硫酸铵盐析 先用50 饱和度去除白蛋白 再用2次33 饱和度沉淀免疫球蛋白 离子交换层析 常用的离子交换剂有DEAE纤维素和QAE纤维素 以QAE Sephadex最理想 能吸附血清中多种蛋白质 但不能吸附IgG 亲和层析法 将纯抗原交联到Sepharose4B 装柱后 将抗血清通过亲和层析柱 特异性吸附IgG 凝胶过滤法 分子筛层析 4 2 2020 30 五 免疫血清的鉴定 1 效价的测定 颗粒性抗原可采用凝集试验 可溶性抗原常用双向免疫扩散试验 ELISA等方法 2 特异性的鉴定 抗体特异性鉴定常用双向免疫扩散法 免疫电泳法 3 纯度的鉴定 抗体纯度的鉴定可
