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1、四 翻译水平的调节 遗传密码的性质 通过校正tRNA的方式校正基因的碱基缺失和插入 为催化DNA拓扑学异构体相互转变的酶之总称 催化DNA链断开和结合的偶联反应 为了分析体外反应机制 用环状DNA为底物 在闭环状双链DNA的拓扑学转变中 要暂时的将DNA的一个链或两个链切断 根据异构体化的方式而分为二个型 切断一个链而改变拓扑结构的称为 型拓扑异构酶 top oisomerase 通过切断二个链来进行的称为 型拓扑异构酶 topoisomerase 属于 型的拓扑异构酶 有大肠杆菌的 蛋白 protein 由分子量11万的单个多肽链所成 及各种真核细胞中存在的切断 结合酶 nicking cl
2、osingenzyme 分子量约6万5千 7万的及分子量约10万的 型拓扑异构酶 有存在于细菌中的DNA促旋酶 噬菌体T4的拓扑异构酶 以及真核细胞中依赖ATP的拓扑异构酶 等 在 型拓扑异构酶中 DNA促旋酶可单独催化闭环状DNA产生超螺旋 这是独特的 一 翻译内含子 translationalintron T4DNA拓扑异构酶在ATP存在下 可使超螺旋DNA变成松散的DNA 其中有DNA双链的断裂 链的旋转 再缝合 全酶由三种亚基六个蛋白质分子组成 分别由基因39 基因52和基因60编码 基因39编码的亚基有520个氨基酸 ATP酶活性 基因52编码的亚基有441个氨基酸 松散DNA超螺旋
3、 基因60编码的亚基有160个氨基酸 结合各亚基 协调功能 这三个亚基的蛋白质顺序已分析清楚 已经获得基因39 52 60的DNA克隆 并在大肠杆菌中高效表达蛋白质 T4DNAtopoisomerase anewATP dependentenzymeessentialforinitiationofT4bacteriophageDNAreplicationNature281 456 461 11October1979 LeroyF Liu Chung ChengLiu BruceM AlbertsDepartmentofBiochemistryandBiophysics Universityof
4、California SanFrancisco California94143 NucleotidesequenceofatypeIIDNAtopoisomerasegene BacteriophageT4gene39NucleicAcidsResearch 1986 Vol 14 No 197751 7765WaiMunHuangDepartmentofCellular ViralandMolecularBiology UniversityofUtahMedicalCenterSaltLakeCity UT84132 USA The52 proteinsubunitofT4DNAtopois
5、omeraseishomologoustothegyrA proteinofgyrase NucleicAcidsRes 1986September25 14 18 7379 7390 WMHuang 对基因60的核苷酸序列分析后 难以排出合适的阅读框架 与它表达产物蛋白质的氨基酸顺序对照 发现在第46位甘氨酸和第47位亮氨酸密码子之间 有50个核苷酸插入 其中紧跟第46位甘氨酸密码的是一个终止密码TAG DNA有义链5 GGCTAG CTC 3 mRNA5 GGCUAG CTC 3 蛋白质序列 甘氨酸亮氨酸 第46位第47位 在细胞中 mRNA中是否也有这段插入序列 人工合成基因60编码区的
6、30聚多核苷酸和插入序列的30聚多核苷酸作为两种探针 分别检测T4感染细胞的RNA 杂交分析 两种探针完全给出相同的杂交图谱一条带 实际上细胞中只有一种RNA 没有发现有mRNA剪切加工的现象 对细胞中基因60的mRNA作核苷酸序列分析 都发现有50核苷酸插入序列的存在 RNA电泳 转移 杂交分析 正极 负极 共三条带 编码区探针 插入序列探针 DNA转录 剪接 无论哪种探针都只有一条相同的带 说明细胞中只有一种RNA 普遍性 1 将50个核苷酸序列插入到LacZ的适当编码序列内 在翻译过程中 大肠杆菌核糖体同样可以跳过这个非翻译序列 产生完整的 半乳糖苷酶 2 在酵母表达系统中 酵母核糖体也
7、能跳过这段序列 产生完整的蛋白质 意义 设想在翻译水平上调控 形成不同的二级结构 Evaluationofthemutationssuggests5requirementsforefficientribosomehopping Aminoacidresidues17to32ofthenascentpeptideTerminationcodonrightaftercodon47Ashorthairpinatthetake offsiteIdentitybetweencodons47and48A50ntspacingbetweencodons47and48 Science Vol239 Issue
8、4843 1005 1012 1988ApersistentuntranslatedsequencewithinbacteriophageT4DNAtopoisomerasegene60WMHuang SZAo SCasjens ROrlandi RZeikus RWeiss DWinge andMFangDepartmentofCellular ViralandMolecularBiology UniversityofUtahMedicalCenter SaltLakeCity84132 abstract A50 nucleotideuntranslatedregionisshowntobe
9、presentwithinthecodingsequenceofEscherichiacolibacteriophageT4gene60 whichencodesoneofthesubunitsforitstypeIIDNAtopoisomerase ThisinterruptionispartofthetranscribedmessengerRNAandappearsnottoberemovedbeforetranslation Thus theusualcolinearitybetweenmessengerRNAandtheencodedproteinsequenceapparentlyd
10、oesnotexistinthiscase Theinterruptionisbracketedbyadirectrepeatoffivebasepairs Amechanismisproposedinwhichfoldingoftheuntranslatedregionbringstogethercodonsseparatedbytheinterruptionsothattheelongatingribosomemayskipthe50nucleotidesduringtranslation Thealternativepossibility thattheproteinisefficien
11、tlytranslatedfromaveryminorandundetectableformofprocessedmessengerRNA seemsunlikely buthasnotbeencompletelyruledout 二 microRNA 三 蛋白质合成过程的调节 1 珠蛋白合成调控 eIF2磷酸化对翻译的调控 红细胞体积很小 直径只有7 8 m 形如圆盘 中间下凹 边缘较厚 它具有弹性和可塑性 在通过直径比它还小的毛细血管时 可以改变形状 通过后仍恢复原形 正常成熟的红细胞没有细胞核 也没有高尔基体和线粒体等细胞器 但它仍具有代谢功能 红细胞内充满着丰富的血红蛋白 血红蛋白约占
12、细胞重量的32 水占64 其余4 为脂质 糖类和各种电解质 哺乳动物网织红细胞蛋白质合成调控研究得较为详细 网织红细胞是红细胞成熟前发育的最后阶段 由它合成的蛋白质90 以上是珠蛋白 珠蛋白铁 卟啉 血红素 血红蛋白 血红素与珠蛋白的合成以平行速度进行 如完整细胞中缺铁或网织红细胞内缺血红素 合成蛋白质的速度下降到原来的10 血红素缺乏造成的影响是生成了一个抑制物血红素调控阻遏物 HCR 分子量80 000 90 000 含有蛋白激酶的性质 可磷酰化eIF 2 80S起始复合物不能形成 加入外源的eIF 2或HCR抗体可克服HCR的影响 有一种专一性的磷酸酶可以催化这个逆反应 2 酵母eIF
13、2的磷酸化对GCN4mRNA翻译起始的激活作用 啤酒酵母的GCN4是一个转录因子 它能特异地结合与许多氨基酸合成酶基因的启动子TGACTC上 诱导基因的转录 GCN4蛋白质合成量的增多是由于GCN4mRNA在翻译时被激活 上游的AUG起始密码子的存在抑制下游ORF的翻译在eIF 2正常水平时 上游的每个ORF都能进行翻译 GCN4的翻译几率较少 在氨基酸饥饿的条件下 磷酸化的eIF 2增多 活化的eIF 2减少 翻译起始复合物的再循环必然受到限制 翻译完uORF1后的核糖体迅速滑过其它uORF 到达GCN4 ORF开始翻译 逃避了其它uORF的抑制 五 翻译后水平的调节 一 蛋白质的成熟1 多
14、余序列的切除胰岛素原的激活 2 蛋白质内含子Intein 蛋白质内含子是蛋白质中的一段多肽链 靠自我剪切的方式从前体蛋白中分离出来 同时两端以肽键的方式相连 特征序列 A B C D E F G六个保守的motif Ser类型 自我剪切过程 Cys类型 用途 构建表达载体 产生蛋白质 NEWENGLANDBioLabsINCIMPACT CNSystem 二 蛋白质高级结构的正确形成 分子伴侣 1 Anfinsen的牛胰核糖核酸酶变性复性试验 RNaseA 50年代末完成全序列测定的第一个蛋白质 124个氨基酸 MW12600 4对二硫键 在8mol L尿素 巯基乙醇存在时 二硫键被破坏 变为
15、松散结构 透析 除去尿素和 巯基乙醇 再加入氧化剂 则重新恢复构象 蛋白质自组装 Selfassembly 假说 第一阶段是成核 nucleation 由于挤压效应或疏水作用 多肽链中的一些小肽段迅速行成螺旋 作为进一步折叠的核心 称为核区 第二阶段是折卷 collapse 已成为核的结构 随后散落成为较大的超二级结构单元的集合体 包括一些 折叠片和 转角的形成 第三阶段是凝集 condensation 上述集合体在原子水平上凝集 形成致密的三级结构 这个实验出色地证明了蛋白质的功能取决于特定的天然构象 而规定其构象所需要的信息包含在它的氨基酸序列中 摘自 基础生物化学 高等教育出版社 200
16、1 7 ChristianB Anfinsen USA 因此获得1972年诺贝尔生理或医学奖 问题 特例 RNase的超稳定性 蛋白质的合成过程 蛋白质合成中 首先合成N端 再向C端延伸 在水相中 亲水的力量迫使多肽链疏水的基团聚集于内部 亲水基团位于外部 新生肽键的折叠在合成早期业已开始 随肽键的延伸同时进行折叠 形成某种结构 这与一条变形伸展的完整肽键的重折叠的情况是完全不同的 发现过程 2 Molecularchaperone的发现过程及定义 1962年 意大利生物学家F M Ritossa在研究果蝇 Drosophila 的发育时 发现 当培养果蝇的温度从正常的25 上升到32 时 幼虫 larvae 细胞中的一些巨型染色体上的新的位点变得异常活跃 研究表明 温度的升高促使一些新基因的表达 这就是热激反应 heat shockresponse 的发现 定义Themolecularchaperoneconcept EllisRJ DepartmentofBiologicalSciences UniversityofWarwick Coventry UK Molecularchap
