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1、第四章微生物发酵产酶及生产工艺 常用的产酶微生物 发酵工艺条件及其控制 酶发酵动力学 固定化微生物细胞发酵产酶 固定化微生物原生质体发酵产酶 内容 第一节常用的产酶微生物 一 应用微生物来开发酶的优点 1 微生物生长繁殖快 生活周期短 因此 用微生物来生产酶产品 生产能力 发酵 几乎可以不受限制地扩大 能够满足迅速扩张的市场需求 2 微生物种类繁多 它们散布于整个地球的各个角落 而且在不同的环境下生存的微生物都有其完全不同的代谢方式 能分解利用不同的底物 3 这一特征就为微生物酶品种的多样性提供了物质基础 4 特别是当基因工程介入时 动植物细胞中存在地酶 几乎都能够利用微生物细胞获得 因此 有
2、计划和仔细地筛选微生物菌种 通常可以获得能够生产几乎任何一种酶的适当细胞 二 用于酶生产微生物的要求 1 酶的产量高 2 容易培养和管理 3 产酶稳定性好 4 利于分离纯化 5 安全可靠 无毒性 1 大肠埃希氏杆菌 简称为大肠杆菌 是最为著名的原核生物 形态 短杆或长杆状 0 5 1 0 1 0 3 0um 革兰氏阴性 运动 周毛 或不运动 无芽孢 一般无荚膜 菌落呈白色至黄白色 扩展 光滑 闪光 Escherich属菌株和大多数大肠杆菌是无害 但也有些大肠杆菌是致病的 会引起腹泻和尿路感染 大肠杆菌的名声主要因它易于在实验室操作 生长迅速 而且营养要求低 应用 大肠杆菌能作为宿主供大量的细菌
3、病毒生长繁殖大肠杆菌也是最早用作基因工程的宿主菌工业上生产谷氨酸脱羧酶 天冬酰胺酶和制备天冬氨酸 苏氨酸及缬氨酸等 三 常见产酶微生物 2 醋酸杆菌 Acetobacter 菌体从椭圆至杆状 单个 成对或成链 革兰氏阴性 运动 周毛 或不运动 不生芽孢 好气 含糖 乙醇和酵母膏的培养基上生长良好 应用 有机酸 食醋等 葡萄糖异构酶 高果糖浆 山梨糖 维C中间体 3 枯草芽孢杆菌 Bacillussubtilis 直状 近直状的杆菌 周生或侧生鞭毛 革兰氏阳性 无荚膜 芽孢0 5 1 5 1 8 m 中生或近中生 枯草芽孢杆菌是工业发酵的重要菌种之一 生产淀粉酶 蛋白酶 5 核苷酸酶 某些氨基酸
4、及核苷 4 根霉 Rhizopus 分类学上属于藻状菌纲 毛霉目 根霉属 根霉因有假根 Rhizoid 而得名 假根的功能是在培养基上固着 并吸收营养 分布于土壤 空气中 常见于淀粉食品上 可引起霉腐变质和水果 蔬菜的腐烂 代表种 米根霉 R oryzae 黑根霉 R nigrican 等 应用 根霉能产生一些酶类 如淀粉酶 果胶酶 脂肪酶等 是生产这些酶类的菌种 在酿酒工业上常用做糖化菌 有些根霉还能产生乳酸 延胡索酸等有机酸 5 曲霉 Aspergillus 分类 多数属于子囊菌亚门 少数属于半知菌亚门 分布 广泛分布于土壤 空气和谷物上 可引起食物 谷物和果蔬的霉腐变质 有的可产生致癌性
5、的黄曲霉毒素 代表种 黑曲霉Asp Niger 黄曲霉Asp flavus应用 是制酱 酿酒 制醋的主要菌种 是生产酶制剂 蛋白酶 淀粉酶 果胶酶 的菌种 生产有机酸 如柠檬酸 葡萄糖酸等 农业上用作生产糖化饲料的菌种 回本节 第二节 微生物酶开发的一般程序 一 样品的采集采样的目的 采样地点 采样方法及采样的数量 微生物酶开发的一般程序 二 菌种的分离培养基的确定 培养条件的确定 微生物酶开发的一般程序 三 菌种的初筛 1 用简单的定性反应进行初筛 2 在最初分离阶段就给予特殊的培养基或培养条件 进而让目的菌株得以繁殖 尽可能地把只成为目的菌的菌株或只将其最适菌株的一株纯化分离 微生物酶开发
6、的一般程序 四 菌种的复筛初筛之后 还要进行复筛 复筛的目的是在初筛的基础上 筛选产酶量高 性能更符合生产要求的菌种 复筛 酶活的测定方法的建立尤其重要 微生物酶开发的一般程序 五 对复筛获得菌株的要求 1 不是致病菌 2 菌株不易变易和退化 3 不易感染噬菌体 4 微生物产酶量高 5 酶的性质符合应用的需要 而且最好是胞外酶 6 产生的酶便于分离和提取 得率高 7 微生物培养营养要求低 微生物酶开发的一般程序 六 最佳产酶条件的初步确定 1 培养方式的确定 2 最佳培养条件组合 3 微生物产酶的特性 胞内酶 胞外酶 4 微生物酶收集的时间顺序 微生物酶开发的一般程序 七 微生物产酶性能的进一
7、步提高 1 获得高产菌种的突变体 微生物酶开发的一般程序 七 微生物产酶性能的进一步提高 2 利用代谢工程和代谢调节机理来提高微生物的酶产量 微生物酶开发的一般程序 七 微生物产酶性能的进一步提高 3 运用遗传工程 基因工程的手段将原有菌株中的目的基因转移到另外一些对生产环境更适应性的微生物细胞之内 使其高效表达 微生物酶开发的一般程序 八 微生物酶的提取方法 1 酶的粗提 2 酶的精制 微生物酶开发的一般程序 九 微生物产酶菌种的保藏 1 斜面 2 沙土管 3 冷冻 淀粉酶的筛选 蛋白酶产生菌的获得方法 应用含酪蛋白的培养基 第三节 发酵工艺条件及其控制 1 培养基 2 发酵条件及控制 3
8、提高产酶的措施 Go Go Go 下一节 本章目录 1 培养基 培养基 是指人工配制的用于细胞培养和发酵的各种营养物质的混合物 分类水分和形态形状用途 各种生物对营养的需求 1 选择适宜的营养物质2 营养物的浓度及配比合适3 物理 化学条件适宜4 经济节约5 精心设计 试验比较 培养不同的微生物必须采用不同的培养条件 培养目的不同 原料的选择和配比不同 不同阶段 培养条件也有所差异 培养基的设计原则 五大要素 碳源 氮源 无机盐 生长因子 水 培养基几乎是一切对微生物进行研究和利用工作的基础 任何培养基都应该具备微生物生长所需要五大营养要素 构成细胞物质或代谢产物中碳架 碳源可作能源 为生命活
9、动提供能量 常用碳源 糖类 醇类 脂类 有机酸 烃类 蛋白质及其降解物 异养微生物 糖类是最好碳源 葡萄糖最为通用 水是微生物最基本的组成分 水是微生物体内和体外的溶剂 吸收营养成分和代谢废物 水是细胞质组分 直接参与各种代谢活动调节细胞温度和保持环境温度的稳定 比热高 传热快 水 碳源 选择合适碳源 以适应目的酶的合成调节机制 构成细胞物质和代谢产物中氮元素 氮源 有机氮源 蛋白胨 酵母膏 牛肉膏 无机氮源 铵盐 硝酸盐 参与酶的组成 构成酶活性基 激活酶活性维持细胞结构的稳定性调节细胞渗透压控制细胞的氧化还原电位 常用 硫酸盐 磷酸盐 氯化物以及含有钾 钠 钙 镁 铁等元素的化合物 氮源
10、无机盐 需要注意合适的碳氮比 生长因子 生长因子是指某些微生物不能用普通的碳源 氮源物质进行合成 而必须另外加入少量的生长需求的有机物质 分类 化学结构分成维生素 氨基酸 嘌呤 或嘧啶 及其衍生物和类脂成分等四类 功能 以辅酶与辅基的形式参与代谢中的酶促反应 实验室中常用酵母膏 蛋白胨 牛肉膏等作为各种生长因子的的需要 麦芽汁 米曲汁等天然培养基中本身含有各种生长因子 实验室的常用培养基 细菌 牛肉膏蛋白胨培养基 或简称普通肉汤培养基 放线菌 高氏1号合成培养基培养 酵母菌 麦芽汁培养基 霉菌 查氏合成培养基 例如枯草芽孢杆菌 一般培养 肉汤培养基或LB培养基 自然转化 基础培养基 观察芽孢
11、生孢子培养基 产蛋白酶 以玉米粉 黄豆饼粉为主的产酶培养基 枯草杆菌BF7658 淀粉酶发酵培养基 玉米粉8 豆饼粉4 磷酸氢二钠0 8 硫酸铵0 4 氯化钙0 2 氯化按0 15 自然pH 枯草杆菌AS1 398中性蛋白酶发酵培养基 玉米粉4 豆饼粉3 麸皮3 2 糠1 磷酸氢二钠0 4 磷酸二氢钾0 03 自然pH 黑曲霉糖化酶发酵培养基 玉米粉10 豆饼粉4 麸皮1 pH4 4 5 0 地衣芽孢杆菌2709碱性蛋白酶发酵培养基 玉米粉5 5 豆饼4 磷酸氢二钠0 4 磷酸二氢钾0 03 pH8 5 黑曲霉AS3 350酸性蛋白酶发酵培养基 玉米粉6 豆饼粉4 玉米浆0 6 氯化钙0 5
12、氯化铵1 磷酸氢二钠0 2 pH5 5 游动放线菌葡萄糖异构酶发酵培养基 糖蜜2 豆饼粉2 磷酸氢二钠0 1 硫酸镁0 05 pH7 2 桔青霉磷酸二酯酶发酵培养基 淀粉水解糖5 蛋白胨0 5 硫酸镁0 05 氯化钙0 04 磷酸氢二钠0 05 磷酸二氢钾0 05 自然pH 黑曲霉AS3 396果胶酶发酵培养基 麸皮5 果胶0 3 硫酸铵2 磷酸二氢钾0 25 硫酸镁0 05 硝酸钠0 02 硫酸亚铁0 001 自然pH 枯草杆菌AS1 398碱性磷酸酶发酵培养基 葡萄糖0 4 乳蛋白水解物0 1 硫酸铵1 氯化钾0 1 氯化钙0 1mmol L 氯化镁1 0mmol L 磷酸氢二钠20mol
13、 L 用pH7 4的Tris HCl缓冲液配制 回本节 2 发酵条件及控制 培养基的pH必须控制在一定的范围内 以满足不同类型微生物的生长繁殖或产生代谢产物 为了维持培养基pH的相对恒定 通常在培养基中加入pH缓冲剂 或在进行工业发酵时补加酸 碱 通常培养条件 细菌与放线菌 pH6 5 8 0酵母菌和霉菌 pH4 6范围内生长 pH值的控制 细胞发酵产酶的最适pH值与生长最适pH值往往有所不同 细胞生产某种酶的最适pH值通常接近于该酶催化反应的最适pH值 有些细胞可以同时产生若干种酶 在生产过程中 通过控制培养基的pH值 往往可以改变各种酶之间的产量比例 一般工艺流程P46 pH对微生物生长繁
14、殖和代谢产物形成影响的主要原因 1 影响原生质膜的性质2 影响酶的活性3 影响营养物质和中间代谢产物的解离 二 影响pH值变化的因素1 基质代谢 1 糖代谢特别是快速利用的糖 分解成小分子酸 醇 使pH下降 糖缺乏 pH上升 是补料的标志之一 2 氮代谢当氨基酸中的 NH2被利用后pH会下降 尿素被分解成NH3 pH上升 NH3利用后pH下降 当碳源不足时氮源当碳源利用pH上升 3 生理酸碱性物质利用后pH会上升或下降 2 产物形成某些产物本身呈酸性或碱性 使发酵液pH变化 如有机酸类产生使pH下降 红霉素 洁霉素 螺旋霉素等抗生素呈碱性 使pH上升 3 菌体自溶 pH上升 发酵后期 pH上升
15、 三 发酵过程pH值的调节及控制1 调整培养基的组分2 在发酵过程中进行控制 添加CaCO3 氨水流加法 尿素流加法3 通过补料调pH4 当补料与调pH发生矛盾时 加酸碱调pH 例 配制不同初始pH的培养基 摇瓶考察发酵情况 pH对产海藻酸裂解酶的影响 例子 不同调pH方法的影响 分别在4种缓冲介质中 于pH6 50一9 50测定天冬酰胺酶酶活力 1甘氨酸介质pH8 00时酶活力最高 2硼酸在pH8 50 酶反应最快3磷酸在pH8 50 酶反应最快4Tris在pH8 50 酶反应最快酶活1 2 4 3 不同pH控制方式对目的突变株ISw330异亮氨酸摇瓶发酵的影响 结果如图所示 1 表示只加C
16、aC03控制pH值 2 表示只加尿素控制 3 表示CaC03和尿素联合控制pH值 异亮氨酸发酵 不同pH值对菌体的形态影响很大 当pH值高于7 5时 菌体易于老化 呈现球状 当pH值低于6 5时菌体同样受抑制 易于老化 而在7 2左右时 菌体是处于产酸期 呈现长的椭圆形 在6 9左右时 菌体处于生长期 呈 八 字形状并占有绝对的优势 pH6 9时 菌体生长旺盛 pH7 15时 对菌体的产酸有利 因此 在发酵的产酸期产酸较高 采用阶段pH控制模式进行发酵 在发酵中前期控制pH6 9 到48h后pH值为7 15 到80h后pH值为7 25 产率22 27g L 产酸率提高12 23 通常在生物学范围内每升高10 生长速度就加快一倍 所以温度直接影响酶反应 对于微生物来说 温度直接影响其生长和合成酶 温度的控制 有些细胞发酵产酶的最适温度与细胞生长最适温度有所不同 而且往往低于生长最适温度 这是由于在较低的温度条件下 可以提高酶所对应的mRNA的稳定性 增加酶生物合成的延续时间 从而提高酶的产量 枯草杆菌的最适生长温度为34 37 黑曲霉的最适生长温度为28 32 溶解氧的控制 溶解氧是指溶
