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1、1血管特异结合短肽 GNSNPKS 受体在胃癌和结肠癌中的差异表达作者：韩宇, 洪流, 吴开春 , 乔泰东, 陈峥 , 樊代明 【关键词】 GNSNPKS;,胃癌;,结肠癌;, 免疫组化摘 要 目的 : 探讨血管特异结合短肽 GNSNPKS 受体（GNSNPKSR）在胃癌和结肠癌中的表达及与肿瘤分化程度的关系。方法: 采用免疫组化 SP 法检测 GNSNPKSR 在胃癌和结肠癌中的表达及其分化程度。结果: GNSNPKSR 在高、 中、 低度分化胃癌的血管中表达率依次为 12/18 (67%)、 17/23 (74%)、 22/24 (92%); 在高、 中、 低度分化结肠癌的血管中的表达率依
2、次为 3/16(19%)、5/21(24%)和 7/23(30%)。GNSNPKSR 在胃癌组织中的表达明显高于结肠癌组织(P005), 在低分化胃癌组织中的表达明显高于高分化和中分化胃癌组织(P005) 。结论: GNSNPKS 与胃癌的血管特异结合, 可作为肿瘤血管抑制治疗的靶向载体。关键词GNSNPKS; 胃癌; 结肠癌; 免疫组化自从 Folkman 等1, 2认识到新生血管的重要作用, 提出“肿瘤生长依赖于血管生成”的观点后, 一种新的治疗策略, 即肿瘤2血管抑制治疗应运而生。肿瘤血管抑制治疗具有协调的优点: 首先药物易于到达靶部位: 血管内皮细胞是药物经静脉途径首先到达的部位, 血
3、管内皮细胞全部暴露在血液中, 药物不需渗透就能直接发挥作用, 无需进入癌细胞内部或通过血脑屏障即可到达肿瘤血管内皮细胞, 达到药物量小而高效3; 其次不易产生耐药性 : 由于肿瘤血管内皮细胞仍属于正常的体细胞, 基因稳定, 异质性小, 不易对药物产生耐药性4; 更为重要的是, 在不同的组织和肿瘤中 , 血管的结构和功能都不同。特别是肿瘤血管表达着的特定表面分子为肿瘤治疗提供了特异靶点5-7。环行七肽 GNSNPKS 为本实验室通过建立环磷酰胺免疫抑制小鼠人胃癌肾包膜下移植瘤模型, 体内筛选噬菌体环行七肽库得到的与胃癌血管特异结合短肽8。已证实, GNSNPKS多肽同血管内皮细胞结合能力较其他对
4、照细胞 LoVo、 Eca109、 HepG2 明显增强8 。但目前为止, GNSNPKS 受体（GNSNPKSR）在胃癌及其他肿瘤中的表达分布尚不清楚。本研究中我们对 GNSNPKSR 在胃癌和结肠癌血管的表达进行了初步检测, 旨在探讨 GNSNPKSR 在不同肿瘤中的表达差异。1 材料和方法1.1 研究对象 65 例胃腺癌, 60 例结肠癌和 12 例正常胃组织石蜡包埋标本取自第四军医大学西京医院病理科, 手术日期20012003 年, 术前患者未经放疗或化疗, 且已明确病理诊断。标3本中男 105 例, 女 32 例, 年龄在 2384 岁。1.2 主要试剂 噬菌体呈现 GNSNPKS、
5、 HRP 标记抗 M13单克隆抗体（mAb） 、 鼠抗人 CD31 mAb、 SP 试剂盒和 DAB 显色试剂盒均购自 Santa Cruz 公司。1.3 免疫组化染色 实验采用常规 SP 法( 链霉素生物素蛋白过氧化物酶连接法)9。每次染色设置 CD31 阳性对照, 用 PBS 代替一抗作为阴性对照。结果判定: GNSNPKS, CD31 以肿瘤组织内血管内皮细胞胞膜和胞浆呈棕色染色为阳性。1.4 统计学分析 采用 SPSS100 统计软件进行 2 检验, 不同肿瘤分期的 MVD 值的差异采用方差分析(AVOVA)。2 结果GNSNPKS 特异结合于肿瘤组织的血管内皮细胞。GNSNPKSR
6、在 51/65 例(78%)胃癌组织中表达, 包括 12 例(67%)高分化胃癌组织, 17 例 (74%)中分化胃癌组织(图 1A)和 22 例(92%)低分化胃癌组织(图 1B)。15/60(25%) 例结肠癌组织可见 GNSNPKS阳性染色, 包括 3 例(19%)高分化结肠癌组织, 5 例(24%) 中分化结肠癌组织(图 1C)和 7 例(30%)低分化结肠癌组织(图 1D)。鼠抗人4CD31 mAb 被用作阳性对照(图 1E)。GNSNPKSR 在 12 例正常胃组织中皆为阴性表达(图 1F)。如表 1 所示, GNSNPKSR 在胃癌组织中的表达明显高于结肠癌组织(P005), 在
7、低分化胃癌组织中的表达明显高于高分化和中分化胃癌组织(P005)。表 1 GNSNPKSR 在胃癌和结肠癌中的表达（略）aP0.05 vs 高分化和中分化胃癌组.图 1 免疫组化检测 GNSNPKS 在胃癌和结肠癌中的表达(200)（略）A: 中分化胃癌; B:低分化胃癌; C: 中分化结肠癌; D: 低分化结肠癌; E: 阳性对照; F: 阴性对照.3 讨论恶性肿瘤严重危害着人类的健康, 长期以来人们一直寻求高效, 低毒的肿瘤治疗方法。抗肿瘤血管抑制治疗以肿瘤血管内皮细胞为靶点, 是具有良好前景的治疗方法 10。血管内皮细胞遗传特异性较为稳定, 很少发生变异, 因此针对血管内皮细胞来治疗肿瘤
8、, 效果稳定, 不易产生耐药性。研究表明, 肿瘤血管往往以低水平表达许多分子标志物, 但在大多情况下, 这些分子标志物不易检测到。因此寻5找肿瘤血管特异表达分子具有十分重要的意义。我们成功地建立了环磷酰胺免疫抑制小鼠人胃癌肾包膜下移植瘤模型, 并进行了随机噬菌体环七肽库体内筛选人胃癌血管特异性结合短肽的实验研究8。结果表明, 筛选得到的呈现噬菌体多肽 GNSNPKS 在移植瘤血管内存在高度富集。GNSNPKS 多肽同血管内皮细胞结合能力较其他对照细胞 LoVo、 Eca109、 HepG2 明显增强。M13 染色提示阳性着色的部位多在胃癌移植瘤的血管内, 并且分布与因子在移植瘤内的分布与极为相
9、似, 而在小鼠的其他对照组织（心、 肝、 脾、 肾、 脑）上几乎无表达。此外, 检测人类组织标本发现, GNSNPKS噬菌体能够同胃癌组织的血管特异性结合, 而在对照组织脾脏、 血管瘤、 肝癌组织上未见明显结合 8, 说明 GNSNPKS 多肽可能为胃癌血管特异性结合多肽。为了验证假设, 我们首次用免疫组化方法检测了 GNSNPKSR 在胃癌和结肠癌组织的表达。统计数据表明, GNSNPKS 在胃癌组织中的表达明显高于结肠癌组织(P005), 在低分化胃癌组织中的表达明显高于高分化和中分化胃癌组织(P005)。因此, 我们推测 GNSNPKSR 与胃癌血管内皮细胞表面特异受体结合, 可能作为细
10、胞因子和化疗药物的载体应用于肿瘤血管靶向治疗, 但其受体的鉴定还需要更为深入的研究。参考文献:1 Folkman J. Tumor angiogenesis: therapeutic 6implicationsJ. N Engl J Med, 1971, 285(5): 1182-1186.2 Gimbrone M, Leapman S, Cotran R, et al. Tumor dormancy in vivo by prevention of neovascularisationJ. J Exp Med, 1972, 136(2): 261-276.3 Tortora G, Melis
11、i D, Ciardiello F. Angiogenesis: a target for cancer therapyJ. Curr Pharm Des, 2004, 10(1): 11-26.4 Holmgren L, OReilly MS, Folkman J. Dormancy of micrometastases: balanced proliferation and apoptosis in the presence of angiogenesis suppressionJ. Nature Med, 1995, 1(2): 149-153.5 Burg MA, Pasqualini
12、 R, Arap W, et al. NG2 proteoglycanbinding peptides target tumor neovasculatureJ. Cancer Res, 1999, 59(8): 2869-2874.6 Essler M, Ruoslahti E. Molecular specialization of breast vasculature: a breas thoming phagedisplayed peptide binds to aminopeptidase P in breast vasculatureJ. Proc Natl 7Acad Sci U
13、SA, 2002, 99(10): 2252-2257.7 Arap W, Haedicke W, Bernasconi M. Targeting the prostate for destruction through a vascular addressJ. Proc Natl Acad Sci USA, 2002, 99(7): 1527-1531.8 Zhi M, Wu KC, Dong L, et al. Characterization of a specific phagedisplayed Peptide binding to vasculature of human gastric cancerJ. Cancer Biology Ther, 2004, 3(12): 1232-1235.9 Hong L, Han Y, Shi R, et al. ZNRD1 gene suppresses cell proliferation through cell cycle arrest in G1 phaseJ. Cancer Biol Ther, 2005, 4(1): 61-65.10 曹姗姗 , 吴开春, 颜 真, 等. 重组融合蛋白GX1rmhTNF 的克隆、 表达及鉴定J. 细胞与分子免疫学杂志, 2006, 22（ 3）:360-362.
