血管抑素的制备

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1、1血管抑素的制备作者：张晓慧,徐海峰, 张金赫 【关键词】 血管抑素 【关键词】 血管抑素;亲和层析法 0 引言 血管抑素(angiostatin，AS)是肿瘤源性血管生成抑制因子,相对分子质量(Mr) 38 0001. AS 包括纤溶酶原(plasminogen, Pgn)的前四个 Kringle 结构,每个 Kringle 上均有特异的赖氨酸结合位点，因此可利用亲和层析的方法从血浆中提取 AS. 1 血管抑素的制备 2取 200 mL 新鲜血浆用蒸馏水做两倍体积稀释，双层滤纸过滤. 取滤后血浆缓慢加入至准备好的 Lysine Sepharose4B 的亲和层析柱上，用恒流泵控制流速 0.5

2、 mL/min；以 58 倍柱床体积pH 为 7.4 的 0.3 mol/L 磷酸缓冲液洗去杂蛋白；再以两倍柱床体积pH 为 7.4 的 0.1 mol/L 磷酸缓冲液洗涤；加入 16.67 nkat 的弹性蛋白酶，用吸管将层析介质悬起，室温酶切 810 h；再以 58 倍柱床体积 pH 为 7.4 的 0.3 mol/L 磷酸缓冲液洗涤. 最后用 0.2 mol/L 6 氨基己酸洗脱，洗脱速度 0.5 mL/min，收集目标蛋白峰，SDSPAGE 鉴定. 2 结果和讨论 2本试验在室温下对弹性蛋白酶取不同的浓度、酶切时间和血浆流速，用正交设计的方法，得出本实验 AS 的最佳制备条件为弹性蛋白

3、酶 16.67 nkat，室温酶切 810 h，血浆流速不超过 40 mL/h. 所制备的 AS 经 SDSPAGE 鉴定，与文献报道一致 . 实验中关键是要掌握好弹性蛋白酶的浓度及酶切时间. 本试验中，弹性蛋白酶 25.00 nkat，酶切时间超过 12 h，纤溶酶原会被过度切割，产生若干种片段，分子量偏小,Mr 约为 20 000 左右；时间过短，纤溶酶原又不能被充分切开. 其次，血浆流速要适中，不要超过 40 mL/h,太快会导致纤溶酶原与层析柱不能充分结合或结合不够牢固，致使 AS 产量偏低；另外还要注意抑制杂菌生长，延长层析柱的使用寿命. 目前 , AS 已进入临床试验,有可能成为一

4、种有效的抗肿瘤药物3. 【参考文献】 1 OReilly MS, Holmgren L, Shing Y, et al. Angiostatin: A novel angiogenesis inhibitor that mediates the suppression of metastases by a lewis lung carcinomaJ . Cell, 1994;79(2):185-188. 2 李福洋. 一步法从血浆中制备血管生成抑制素J . 第四军医大学学报，1999;20(2):75-78. 3 Kirsch M, Santarius T, Black PM, et al. Therapeutic antiangiogenesis for malignant brain tumorsJ. Oncology, 2001;24(5):423-430.3