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1、平台简介：以家蚕作为生物反应器，利用分子生物学手段，构建了系统的家蚕杆状病毒高效表达药用外源蛋白体系，建立了全方位的具有自主知识产权的生物医药产业化平台。我们在国际上首次克隆家蚕杆状病毒（BmNPV）的P10基因并证明P10启动子也是强启动子，具备作为表达载体启动子的功能特征，首次利用BmNPV P10启动子在家蚕细胞中表达了氯霉素乙酰基转移酶。成功构建重组可救活线性化家蚕核多角体病毒基因工程载体，筛选效率提高1000倍，时间缩短10倍；成功构建半胱氨酸蛋白缺失型家蚕核多角体病毒基因工程载体，表达效率提高40%。通过构建一系列的新型重组病毒和表达载体，形成全新的家蚕生物反应器技术平台。此后，以
2、家蚕生物反应器技术平台生产口服疫苗和药物为研究特色，建立了家蚕生物反应器生物制药技术平台和家蚕功能基因组研究技术平台，主要致力于应用基因工程技术和生化下游技术制备药物及疫苗，探索基因工程药物（疫苗）口服途径及其产业化，同时开展家蚕功能基因组学的研究，探索家蚕生长发育中的基因调控机制。在国内外学术刊物上发表研究论文170余篇，其中被SCI收录 40余篇，编写专著6本；完成科研项目26项，其中国家级13项，省部级10项，在研项目4项；获得国家发明专利14项，公开国家发明专利5项；在国际学术刊物上发表研究论文37篇；申请国家发明专利17项，获得国家发明专利7项。在家蚕生物反应器生产口服药物和疫苗的研
3、究、家蚕功能基因组学和蛋白质组学以及家蚕RNA相关研究中都取得了新的突破。平台具体内容、研究成果：一、家蚕生物反应器生产口服蛋白质药物技术平台体系的构建通过一系列的新型基因工程载体的构建，成功建立家蚕生物反应器蛋白表达技术平台。家蚕生物反应器表达的产物经证实可以直接用于口服药物的开发，目前已经证明家蚕表达生产的药物由于有蚕血淋巴本身的大量蛋白的保护作用和一些未知的机理，直接经口服给药而进入血液循环。这类药物既可以免去药物的分离纯化过程，又可解除病人注射的痛苦和被感染的危险。(1) 家蚕生物反应器蛋白高效表达技术平台的构建国际上首次克隆并测序家蚕杆状病毒（BmNPV）的P10基因（GenBank
4、 登录号为S76783），并证明P10启动子也是强启动子，具备作为表达载体启动子的功能特征，此后，首次利用P10启动子在家蚕细胞中表达了氯霉素乙酰基转移酶；通过野生型家蚕核多角体病毒中国镇江株BmNPV ZJ8基因组与修饰型苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒AcNPV BacPAK6基因组在家蚕细胞内同源重组，构建成重组救活可线性化修饰型家蚕核多角体病毒基因工程载体BmBacPAK6。BmBacPAK6含有Lac Z基因和两个Bsu36 I酶切位点用于线性化。BmBacPAK6用作外源基因表达重组救活病毒筛出率几近100。BmBacPAK6用作载体表达人EPO基因，感染家蚕虫体和家蚕蛹时，EPO表达量达
5、7.4104U/ml血淋巴；在此基础上，成功构建半胱氨酸蛋白酶缺失型BmNPV基因工程载体，通过一种半胱氨酸蛋白酶基因缺失型家蚕核多角体病毒BmZJCP基因组DNA和构建的转移载体pCP-GFP与上述BmBacPAK6共转染家蚕细胞，经细胞内同源重组获得。此半胱氨酸蛋白酶缺失型病毒感染的家蚕细胞中，外源基因表达量比对照高约40，宿主存活期及产物高表达期延长，从而提高总表达量。通过构建一系列的新型重组病毒和新型表达载体，形成全新的家蚕生物反应器蛋白高效表达技术平台。(2) 口服有效的rhGM-CSF蛋白药物的制备及其生白效果至今，有很多的外源蛋白在家蚕细胞和幼虫中得到表达，但作为生物反应器，家蚕
6、蛹可能更加适合表达外源目的基因。我们通过重组家蚕杆状病毒在家蚕蛹中成功表达了人粒细胞-巨细胞激落刺激因子（hGM-CSF）。表达的重组蛋白rhGM-CSF分子量为29kDa，等电点5.1，脱糖基化分析表明和大肠杆菌表达rhGM-CSF相比，家蚕蛹表达rhGM-CSF经过了糖基化后修饰，同时还可能经过了其他的翻译后修饰。重组家蚕蛹蛋白粗提物中rhGM-CSF比活达到6.8106 cfu mg-1，经纯化我们得到比活大于8.4106 cfu mg-1的重组蛋白。本研究表明家蚕蛹能够作为一种方便的低成本的生物反应器用于外源基因的表达。相关研究成果发表在J. Biotechnol.上。我们通过家蚕蛹生
7、物反应器高效表达了rhGM-CSF，为了进一步研究家蚕蛹所表达的rhGM-CSF药效功能，从家蚕蛹中大规模纯化重组蛋白成为一个较大的挑战。我们建立了两个大量纯化重组蛋白的方法：分别采用硫酸铵分级沉淀和等电点沉淀法得到重组蛋白的初步纯化产物，然后再结合凝胶过滤和离子交换色谱法得到纯化的蛋白。研究表明，采用等电点沉淀法可能更加有效，通过这种方法，我们从1000g接种感染的蚕蛹中纯化得到95纯度的重组蛋白11.7mg，其比活高达9.0106 cfu mg-1。和其他方法相比，该方法纯化蛋白的得率提高了大约40。相关研究成果发表在Appl. Biochem. Biotech.上。家蚕生物反应器表达的r
8、hGM-CSF为29kDa糖蛋白（BmrhGM-CSF）。生物活性检测表明，BmrhGM-CSF具有刺激人骨髓细胞形成集落的能力，集落形成效果和BmrhGM-CSF成剂量依赖关系，和射线的照射的浓度呈负相关。动物试验表明，口服BmrhGM-CSF15分钟后，可以在老鼠的血液中检测到20kDa125I标记的BmrhGM-CSF蛋白片段。免疫组化试验显示可以在老鼠肠的组织细胞中检测到BmrhGM-CSF。这些结果表明BmrhGM-CSF可能通过动物肠微绒毛被吸收到动物血液中。动物药理学试验进一步证实：（1）BmrhGM-CSF能提高白细胞减少症小鼠脾脏的CFU-S形成能力和骨髓细胞中DNA合成能力
9、；（2）BmrhGM-CSF能显著诱导恒河猴和狗骨髓粒细胞和核细胞的生长，口服BmrhGM-CSF9天后，动物的白细胞水平显著提高，且呈剂量依赖关系。高剂量组狗的白细胞水平达到1.5109cells/L，远远高于阴性对照组的狗。同时骨髓涂片试验表明，口服BmrhGM-CSF动物的白细胞中肌胚细胞和前颗粒性细胞所占百分比远远高于阴性对照组动物。以上结果表明家蚕生物反应器生产的29kDa BmrhGM-CSF作为具有生物活性的细胞因子能够通过口服产生效果，这为蛋白口服药物的研制开辟了一条新的途径。研制hGM-CSF胶囊（瑞福康），经国家新药评审中心评审同意进入临床试验（临床批件号：2003L025
10、11），“蚕表达基因工程生白细胞药物的方法”已获得国家发明专利（专利号：ZL98124614.1）,相关研究成果发表在Eur. J. Pharm. Sci.上。为了研究家蚕生物反应器表达的BmrhGM-CSF在人体内的口服吸收利用度，我们以每100mg蚕蛹粉中含12g的BmrhGM-CSF制成胶囊，根据双处理、双周期、两序列的随机交叉试验设计方法，选择21例志愿者，口服BmrhGM-CSF8g/kg或皮下注射大肠杆菌表达的rhGM-CSF3.75g /kg，给药后按0、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、8.0、10.0、12.0h自臂静脉取血，ELISA
11、法测定血液中hGM-CSF浓度，结果表明19人口服BmrhGM-CSF后，有15人血液中检测到与正常血浆有显著差异的血药浓度，用梯形面积法计算药时曲线下面积AUC，根据试验品的AUC与参比品的AUC比值计算相对生物利用度F值，BmrhGM-CSF经口服后在人体中平均生物利用度为0.605%，在15人中有效吸收的平均生物利用度为0.959%，最高为3.097。受试者的血浆经质谱分析找到了来自hGM-CSF的相关片段的序列，序列最大分子量达到7336Da，最小达到2039 Da，说明BmrhGM-CSF经过口服能被人体吸收。5个剂量组27名受试者单次口服150900g的rhGM-CSF胶囊的一般检
12、查、血生化、血液学、尿液和心电图检查结果用药前后均无具临床意义的改变，无药物不良反应发生。18例恶性肿瘤患者在化疗结束24小时后开始口服BmrhGM-CSF胶囊相对安慰剂组能明显减慢或阻止白细胞下降。30例接受放、化疗患者口服BmrhGM-CSF胶囊，5天内使白细胞恢复到4109/L上，总有效率达90%，说明经吸收的BmrhGM-CSF在人体内具有活性、具有升高白细胞的功能。相关研究成果拟发表在PLoS One。(3) 糖尿病基因工程口服疫苗的制备及其对I型糖尿病的治疗研究由于家蚕生物反应器表达蛋白进行翻译后修饰，其表达产物生物活性可以和天然蛋白相媲美，我们开展了口服家蚕表达霍乱毒素B亚基（C
13、TB）与胰岛素融合蛋白对治疗自身免疫性糖尿病的研究。I型糖尿病由胰岛素分泌缺陷产生，它是一种针对胰岛细胞的自身免疫性疫病。动物实验表明通过口服一种自身抗原，如胰岛素或GAD，即诱导了免疫耐受，产生了保护作用，进而抑制糖尿病的发生。口服疾病特异性自身抗原能诱导口服免疫耐受，并能有效延缓或抑制自身免疫性疾病症状的发生。在体内成功诱导免疫耐受需要长期口服大量的蛋白抗原， CTB可作为诱导口服耐受的强大粘膜运载系统，自身抗原通过与CTB蛋白偶联可极大地较少口服自身抗原的剂量。这些都暗示CTB偶联自身抗原不仅使口服耐受防治I型糖尿病等自身免疫性疫病更具有实际应用价值，而且还有潜在的治疗前景。因此，在本研
14、究中我们构建了CTB与人胰岛素融合基因（CTB-INS），并在家蚕中得到高效表达，融合蛋白（20kDa）在家蚕幼虫的蚕血淋巴中表达量达到0.3mg/ml。经检测，该融合蛋白在家蚕中以五聚体形式存在，并且保持GM1神经节苷脂的受体结合特性以及CTB和胰岛素的抗原性。非肥胖性糖尿病（NOD）小鼠经口服含微克级的CTB与胰岛素融合蛋白的蚕血淋巴，病理组织切片实验表明胰岛发炎程度显著减轻。适时监测血糖的实验结果亦表明糖尿病的病理症状得到明显延缓，过继转移实验亦表明口服该融合蛋白产生了潜在的调节性T细胞从而抑制糖尿病的发生。这些结果表明家蚕生物反应器是一个合适的生产口服疫苗系统，并通过该系统诱导针对T细
15、胞介导的自身免疫疾病的免疫耐受，该研究是利用我国自身蚕业资源优势研制抗I型糖尿病口服疫苗，为I型糖尿病的治疗开辟了新的途径。相关研究成果发表在J. Biotechnol.和J. Biochem.Mol. Biol.上。为了提高融合基因CTB-INS在家蚕杆状病毒表达系统中的表达水平，我们同时开展了部分多角体同源序列对外源基因在杆状病毒表达系统中表达的影响分析。本研究在融合基因CTB-INS的5端融合了部分来自多角体基因的5非编码区（ATAAAT）和编码区（ATGCCGAAT）共15bp的核酸序列，因此与原CTB-INS融合蛋白相比，经过修饰的融合蛋白（mCTB-INS）在其N末端增加了两个氨基
16、酸Pro-Asn。我们将新的融合蛋白mCTB-INS在家蚕细胞和幼虫中分别表达，结果发现由于融合了部分多角体同源序列（PPHS），新的蛋白的表达量与原CTB-INS蛋白相比提高了近4倍。进一步分析得知，新蛋白N端增加的两个氨基酸并未显著影响其与神经节苷脂（GM1）的结合能力。因此，本实验中所使用的15bp多角体同源序列可被用作为一个结构元件，在多角体启动子下游促进外源基因的高效表达。相关研究成果发表在Biotech. Appl. Biochem.上。我们同时关注口服家蚕表达CTB与胰岛素B链融合蛋白对治疗糖尿病的效果。胰岛素B链包含了胰岛素的主要抗原决定族，仅仅口服胰岛素B链在动物模型中同样能抑制糖尿病的发生，其效果与口服胰岛素完整蛋白相近。经检测，我们构建的CTB与人胰岛素B链融合蛋白在家蚕中以五聚体形式存在，并且保持GM1神经节苷脂的受体结合特性以及CTB的抗原性。非肥胖性糖尿病小鼠经口服含微克级的CTB与胰岛素B链融合蛋白的蚕血淋巴，病理组织切片实验表明小鼠胰岛发炎
