《融合蛋白HSP70EGFP的表达、纯化及其在树突状细胞内化抗原中的应用》由会员分享，可在线阅读，更多相关《融合蛋白HSP70EGFP的表达、纯化及其在树突状细胞内化抗原中的应用（12页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1融合蛋白 HSP70EGFP 的表达、纯化及其在树突状细胞内化抗原中的应用【摘要】 目的： 研究树突状细胞（ DCs）对热休克蛋白70（HSP70）融合蛋白的内化作用. 方法： 首先原核表达并分离纯化 HSP70 和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的融合蛋白HSP70EGFP. 实验中所用 DCs 来源于人外周血 . 内化实验分 3 组进行：将 1，2 组 DCs 分别与融合蛋白 HSP70EGFP和蛋白 EGFP孵育 30 min；第 3 组先将 DCs 与 HSP70 孵育 30 min，再与HSP70EGFP孵育 30 min. 之后将 3 组 DCs 转至 37 孵箱内，培养 0.5，
2、1，2 和 24 h，应用流式细胞仪检测含 HSP70EGFP或EGFP 的 DCs 数量. 应用 IL12 Elispot法检测 HSP70EGFP等抗原促进 DCs 分泌 IL12的效果. 结果： 成功获得了重组蛋白HSP70EGFP， Mr 约为 97 000，HSP70EGFP 表达量占总蛋白的 35.7%. 纯化后的融合蛋白 HSP70EGFP溶液经紫外线灯照射时发出鲜绿色的荧光. 流式细胞仪检测结果显示在 37 孵育 0.5 h 后，HSP70EGFP 孵育的 DCs 组阳性率为 63.3%，其余两组为阴性. 在 37 孵育 1，2 和 24 h 后，3 组阳性率均大于 80.0%
3、. IL12 Elispot检测结果显示，在刺激 DCs 活化及分泌 IL12的水平上，HSP70EGFP 与脂多糖（LPS）之间的差别无统计学意义(P0.05)，而 HSP70EGFP的活化 DCs 能力明显高于 EGFP (P=0.001). 结论： 受体介导的吞噬作用在 DCs 内化2HSP70EGFP的初始阶段起主要作用，随孵育时间的延续，吞饮作用占主要地位. HSP70EGFP可促进 DCs 分泌特征性细胞因子IL12. 【关键词】 吞噬作用；受体介导；树突细胞；重组融合蛋白质类；热休克蛋白质 70；绿色荧光蛋白质类热休克蛋白家族在肿瘤免疫中发挥着免疫佐剂的功能，对开发肿瘤疫苗具有重
4、要意义. 许多研究采用标记的热休克蛋白观察 HSP肽复合物在抗原递呈细胞（antigen presenting cell, APC）上的呈递过程，发现 APC 表面存在 HSP 受体1-2. 有研究发现，gp96 融合蛋白与受体结合后，可以激活树突状细胞（dendritic cells，DCs）分泌 IL12和 TNF，增强其抗原递呈能力3. 而对热休克蛋白 70（heat shock protein, HSP70）融合蛋白在抗原递呈细胞上的递呈过程的研究报道较少. 我们设计了HSP70 和具有示踪功能的增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescence protein
5、, EGFP）的融合蛋白 HSP70EGFP，以探讨DCs 内化外源性抗原的方式及不同抗原对 DCs 的活化效果.1 材料和方法1.1 材料3新鲜全血由健康志愿者提供；质粒 pIRES2EGFP（美国Clontech 公司） ；原核表达载体 pET28a(+)HSP70由第四军医大学病理学教研室陈广生博士构建；NiNTA His.Bind 树脂（美国Novagen 公司产品） ； rhIL4，rhIL2 （美国 R&D 生物工程公司产品） ；rhGMCSF 由厦门特宝生物工程公司生产；鼠抗人McAbCD1a，CD80 和 HLADR（美国 Sigma 公司） ；羊抗鼠IgGFITC（武汉生物制
6、品公司） ；人 IL12 Elispot系统（法国DIACLONE 公司产品） ；蛋白 HSP70，MAGE1 由第四军医大学病理学教研室惠赠；蛋白 EGFP 的制备按文献3 的方法进行.1.2 方法1.2.1 载体的构建根据 EGFP 的基因序列，设计引物，用 PCR 技术从质粒pIRES2EGFP中扩增 EGFP，上游引物为：5 CCT GAG CTC ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG 3，下游引物为：5 GCG CTC GAG TTA CTT GTA CAG CTC GTC CAT G3，分别包含了SacI 和 XhoI 的内切酶位点( 划线部分). 将 EGFP
7、基因克隆到pET28a(+)HSP70原核表达载体上，与 HSP70 基因融合，转化E.coli DH5宿主菌，挑取单克隆菌落，提取质粒进行酶切鉴定，4酶切产物进行 10 g/L 琼脂糖凝胶电泳.1.2.2 融合蛋白的表达将重组质粒转化入 E.coli BL21(DE3)，用卡那霉素筛选. 培养含有 HSP70EGFP融合基因的 BL21 大肠杆菌至对数生长期，加入 IPTG 至终浓度 0.1 mmol/L，4 诱导表达 1218 h，收菌. SDSPAGE分析融合蛋白的表达.1.2.3HSP70EGFP 融合蛋白的分离与纯化用 50 mmol/L 磷酸缓冲液+300 mmol/L NaCl，
8、 pH 8.0，充分悬浮细菌，冰浴、超声裂解细菌，离心收集上清变性蛋白. 用22 m滤膜过滤，Ni 离子亲和层析柱层析，250 mmol/L 咪唑溶液洗脱，收集洗脱峰. SDSPAGE分析纯化蛋白.1.2.4 树突状细胞的培养采用文献4的方法分离、诱导及分化外周血中的 DCs. 在培养的不同阶段收集悬浮细胞，在光镜下观察细胞的形态，用流式细胞仪检测 DCs 表型 .51.2.5 内化实验实验分为三组，每组含 1106 DCs，孵育蛋白浓度为 100 mg /L. 将 1，2 组 DCs 分别与 EGFP 和 HSP70EGFP于 4孵育30 min；第 3 组 DCs 先与 HSP70 在 4
9、C 孵育 30 min，洗涤 3 遍，再将 DCs 与 HSP70EGFP在 4孵育 30 min. 之后将三组 DCs转至 37，50 mL/L CO2 孵箱内，分别培养 0.5，1，2 和 24 h. 流式细胞仪检测胞内含 EGFP 的 DCs 数量，阴性对照组除孵育蛋白为 MAGE1 外，其余各项同 1，2 组.1.2.6Elispot 检测用人 IL12 Elispot系统（Human IL12 Elispot system）检测活化成熟后释放 IL12的 DCs 细胞频数. 依刺激物不同，分别为：1 mg/L LPS；95 灭活 10 min 的 1 mg/L LPS；10 mg/L
10、 HSP70EGFP；10 mg/L EGFP；无刺激物. 实验分 5 组进行，每组设 3 个复孔，加入培养 56 d 的 1105 DCs 作为效应细胞. Elispot检测按照试剂盒使用说明进行.统计学处理： 用 SPSS 12.0 统计学软件进行方差分析，实验数据以 xs 表示， P0.05）.2.5IL12 酶联免疫斑点实验结果HSP70EGFP刺激物组平均斑点数为 134.097.05/1105 DCs 细胞，明显高于灭活 LPS 刺激物组，平均斑点数为：（33.781.40/1105 DCs 细胞）和 EGFP 刺激物组，平均斑点数为：（23.130.31/1105 DCs 细胞）
11、 （P0.05).83 讨论HSP70 与不同抗原的融合蛋白作为肿瘤疫苗，具有明显的抗肿瘤免疫作用5-8 . 其原因在于 HSP70 具有免疫载体分子的作用，能增强与之结合抗原的抗原性，并发现 HSP70 融合蛋白可诱导机体产生特异性 CTL 反应的部分主要为其 N 端约 360 aa 部分9. 本研究将 EGFP 连接于 HSP70 C 端，获得重组蛋白HSP70EGFP，研究 DCs 对 HSP70 融合蛋白的内化作用 . HSP70EGFP的获得，不仅保持了 HSP70 诱导细胞免疫活性的功能，还提供了可发出绿色荧光的 EGFP，免去再标记 HSP70 融合蛋白的过程，为示踪 DCs 对
12、 HSP70 融合蛋白的内化作用提供了新手段. 有研究发现结构型 Hsc70 和葡萄糖调节蛋白94(glucoseregulated protein, GRP94/gp96)结合 APCs（B 细胞、巨噬细胞和 DCs）通过特异性膜受体被内化10-12. Basu等13的研究发现，gp96 肽复合物经 APC 摄取后由 MHCI分子递呈给免疫系统，这一过程是由受体 CD91 所介导的. 2巨球蛋白受体又称为低密度脂蛋白相关蛋白，被确认为 gp96 和 hsc70在鼠 APCs 的受体. gp96肽复合物被摄取后的加工过程需要在蛋白酶体和抗原加工相关转运蛋白的协助下，通过经典的内源性抗原递9呈途经与 APC 表面 MHCI分子结合. 本研究发现，DCs 表面存在 HSP70 受体，介导了HSP70EGFP的内化，并且该受体可被过量 HSP70 所饱和，受体介导的内化作用同时被抑制. 随孵育时间的延续，三组实验中胞内具荧光的 DCs 均占总 DCs 数量的绝大多数，表明随着时间的推移，除受体介导的内化作用外，DCs 对可溶性蛋白的吞饮作用导致了HSP70EGFP及 EGFP 的内化. IL12 Elispot检测结果表明，HSP70EGFP可以诱导 DCs 分泌细胞因子 IL12，而 IL12有强烈的抗病毒和抗肿瘤效应
