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1、1菲立磁标记的大鼠骨髓基质干细胞在同种异体移植鼠肝脏中的追踪观察作者：陈小伍，方驰华，刘胜军，崔冰，王岩，黄治荣【关键词】 骨髓基质干细胞；菲立磁；磁共振成像；干细胞移植【Abstract】 AIM： To study the method of tracking of allogenically grafted rat bone marrow stem cells （BMSCs） labeled with Feridex in rat liver. METHODS：Feridex was used to label isolated BMSCs. Labeled BMSCs were exa
2、mined by Prussian blue staining and electron microscopy. Successfully labeled BMSCs (2.0 mL，1109/L) were respectively transplanted through portal vein, local liver parenchyma and caudal vein of the SD rats. Six hours before transplantation and 6 h, 1, 3, and 5 weeks after transplantation, magnetic r
3、esonance imaging (MRI) examination (the sequences used were SET2WI, FSET2WI, GRET2WI) was conducted on rat livers. RESULTS： Prussian blue staining confirmed the labeling efficiency was above 90%, and transmission electron microscopy showed numerous iron particles in the cytoplasm of Feridexlabeled B
4、MSCs. MRI (SET2WI) showed: no 2remarkable low signal change was found in the liver images before transplantation of all 3 groups. In the porta hepatis of portal vein transplantation group remarkable low signal changes were seen 6 h after transplantation and the extent gradually expanded 1 and 3 week
5、s after transplantation, while the low signal change could not be seen 5 weeks after transplantation. In the section where the cells were injected in of liver topical transplantation group remarkable low signal changes were seen 6 h after transplantation and the extent gradually expanded 1, 3 and 5
6、weeks after transplantation. No remarkable low signal change was found in the liver images of caudal vein transplantation group at all time points after transplantation. CONCLUSION： Allogenically grafted Feridexlabeled BMSCs can be tracked effectively in rat liver by MRI.【Keywords】 bone marrow stem
7、cells；Feridex ；magnetic resonance imaging；stem cell transplantation【摘要】 目的：研究菲立磁标记的大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)在同种异体移植鼠肝脏中的追踪方法. 方法： 采用菲立磁（Feridex）对分离培养的 BMSCs 进行标记， Prussian blue 染色3和电镜观察对标记后的 BMSCs 进行鉴定；取鉴定后的 BMSCs 2 mL（1109/L）分别注射到 SD 异体大鼠的门静脉、肝局部实质、尾静脉内；采用磁共振成像(MRI)技术（SET2WI，FSET2WI，GRET2WI 序列）分别对移植前 6 h,移植
8、后6 h， 1，3 和 5 wk 时的大鼠肝脏进行扫描. 结果：Prussian blue染色证实 Feridex 标记 BMSCs 阳性率90，透射电镜见铁颗粒位于 BMSCs 胞质中；MRI 扫描 SET2WI 序列成像显示：各移植组在移植前肝脏均未见异常低信号区；门静脉组大鼠移植后 6 h 在肝门部可见异常的低信号改变，1，3 wk 低信号改变范围逐渐扩大，第 5 周时低信号改变消失；肝内注射组大鼠移植后 6 h 在肝脏局部注入区域可见异常的低信号改变，1，3 ，5 wk 低信号改变区域逐渐扩大. 尾静脉组在移植后各时间点均未见到异常低信号改变. 结论：Feridex 标记的大鼠 BMS
9、Cs 在同种异体移植鼠肝脏中可用 MRI 进行有效的追踪.【关键词】 骨髓基质干细胞；菲立磁；磁共振成像；干细胞移植0 引言国内外研究1-2表明，骨髓基质干细胞（ bone marrow stem cells，BMSCs）在一定的条件下，可分化为有功能的肝细胞，4且获取及体外培养容易，没有伦理道德的争议，可以作为种子细胞来治疗急慢性肝功能衰竭和修复肝脏损伤，具有极大的研究价值. 但同种异体移植后 BMSCs 在活体肝内的定居、迁移和分化机制尚不清楚. 我们利用直径为纳米级别的超顺磁性氧化铁粒子菲立磁（feridex）对大鼠 BMSCs 进行标记，并利用磁共振成像(magnetic resona
10、nce imaging，MRI) 技术对多种途径同种异体移植的 BMSCs 在大鼠肝内进行了定位与追踪.1 材料和方法1.1 材料 SD 清洁级大鼠（80100 g，2 只，供提取骨髓用；200 220 g，雄性 36 只，供同种异体细胞移植用）购自广州军区广州总医院动物实验室. Feridex 购自美国泛华医药公司. DMEM（低糖）培养基购自美国 GIBCO 公司；优质胎牛血清购自奥地利 PAA 公司；胰蛋白酶购自 AMERSCO 公司；其他化学试剂为国产分析纯. Olympus 相差显微镜，HERAEUS 超净台，FORUM CO2 培养箱，东芝 1.5T 超导 MRI 机（型号 Exe
11、lart/P3）.1.2 方法1.2.1BMSCs 分离、培养、鉴定及传代 percoll 梯度离心法(连续密度梯度离心分离法)分离纯化大鼠 BMSCs. 采用密度为 1.073 5kg/L 的 Percoll 液分离骨髓液，离心后 BMSCs 将聚积在第二层. 完整取大鼠双后肢股骨，DHanks 液吹吸骨髓 . 抗凝骨髓经低糖的DMEM 培养基稀释. 将比重为 1.073 kg/L 的 Percoll 置试管底部，按照 11 的比例缓慢滴加稀释后的骨髓，900 g/min 离心 30 min. 收获分离的单个核细胞，DMEM 洗两次，接种于 24 孔板内，各孔内加入 100 mL/L 胎牛血
12、清，48 h 后除去非贴壁细胞，更换新鲜培养液，50 mL/L CO2，37和饱和湿度的条件下培养，待细胞生长至瓶底 90%融合时，2.5 g/L 胰蛋白酶消化，传代培养. 收集第 4代 BMSCs，流式细胞仪检测 CD29，CD44，CD45 等表面标志、成骨诱导后行细胞碱性磷酸酶染色. 具体方法参照文献3.1.2.2Feridex 标记 BMSCs 的制备取第 3 代对数生长期的BMSCs，消化后机械吹打成单细胞，以约 5108/L 的密度接种到含有不同浓度 Feridex 的 200 mL/L 胎牛血清培养基(低糖 DMEM)中孵育. 标记培养基中 Fe3+浓度为 16.8 mg/L.
13、50 mL/L CO2，37培养 48 h. 2.5 g/L 胰蛋白酶消化， PBS 重悬，计数后备用. Prussian blue 染色及透射电镜鉴定铁颗粒是否被吞噬进细胞.1.2.3Feridex 标记 BMSCs 大鼠同种异体移植及 MRI 追踪细胞移植：36 只 SD 大鼠同室同条件饲养. 设门静脉组、肝内注射组、尾静脉组，每组 6 只，并每组设 6 只为对照. 经 10 mg/L 水合氯醛（1 mg/kg 体质量）腹腔麻醉后固定，门静脉组、肝内组：消毒6腹部皮肤，分层进入腹腔，暴露肝脏，显露肝门部，解剖门静脉. 门静脉注射组用微量注射器在 15 min 内向门静脉缓慢注入细胞悬液 2
14、 mL（含 BMSCs 1.0109/L） ，留针 10 min，拔针后局部按压止血；肝内注射组直接向肝尾状叶下半部内注入同等剂量的细胞悬液 2 mL，方法同上. 见无明显渗血后，300 mg/L 双氧水冲洗术区；逐层关闭腹腔，碘伏消毒皮肤切口. 术后给予庆大霉素 1104 U，1 次/d 腹腔注射，持续 7 d，单笼饲养. 尾静脉组：穿刺前先将尾部放在 4550温水中浸润 0.5 min,乙醇擦拭，小针穿刺，见回血后，在 15 min 内缓慢注入标记后的 BMSCs 悬液 2 mL（含BMSCs 1.0109/L 或 2.0109/L 或 3.0109/L） ，对照大鼠注入未标记的 BMSC
15、s 悬液 2 mL. 留针 10 min，拔针后局部按压止血.1.2.4MRI 检查所使用的 MRI 机为 1.5T 场强. 为保证大鼠肝脏信号有效显示，采用小型相控阵线圈采集和接受信号（本实验使用膝关节线圈检查）,并在每次扫描前进行匀场. 检查时同前方法麻醉后俯卧位固定于有机玻璃板上，并置于线圈中央. 扫描序列为 SE T2WI, FSET2WI, GRET2WI，并对图像的清晰度、对比度、解剖形态等各方面进行综合对比，以选定最佳的成像序列进行扫描分析. 扫描主要参数为：TR=4900 ms，TE=100 ms，翻转角为90/160，2 次采集，层厚 3 mm. 扫描前采用三轴定位图预设扫描
16、视野（FOV ） ，以适应大鼠的体型，保证有较好的信噪比. 分别于移植术前 6 h、移植术后 6 h，1，3 和 5 wk 对大鼠肝脏行 MRI 检查.71.2.5 组织学检查 MRI 检查后解剖大鼠肝脏，观察肝脏组织，并取肝组织（肝内组取肝尾状叶下半部、门静脉组和尾静脉组取肝门部及各肝叶部位）行 4 m 冰冻连续冠状切片，最后行 Prussian blue 染色和核固红复染.2 结果2.1BMSCs 培养与鉴定原代细胞接种后 24 h 内，单个核细胞贴壁，48 h 可见部分贴壁细胞开始分裂增生，细胞形态为多角形、梭形或纺锤形. 未贴壁细胞随换液而逐步消除 . 1 wk 后贴壁细胞体积增大，有长杆状、三角形、多边形细胞等. 形成多个细胞集落，大小不一，呈旋涡状. 原代细胞生长至 90左右时传代. 传代后细胞增长速度加快，平均 5 d 左右传代. 第 3 代第 5 代细胞生长状态较好. 第 6 代开始细胞增长速度变慢，细胞生长状态亦变差. 第 3代 BM
