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1、1药疹病人 EB 病毒和人疱疹病毒 6 型感染检测作者：杨婷婷 朱桂芝 陈官芝 罗兵 【摘要 】 目的 探讨 EB 病毒（EBV ）和人疱疹病毒 6 型（HHV6）感染在药疹发生中的作用。方法 采用 PCRSouthern blotting 检测药疹病人和正常对照组外周血单个核细胞中 EBV DNA；采用巢式聚合酶链反应检测 HHV6 DNA，并对 HHV6 阳性标本进行酶切分型；采用 ELISA 法检测 EBV VCAIgM；采用RTPCRSouthern blotting 检测 EBV 即刻早期基因 BZLF1 mRNA。结果 药疹病人 EBV DNA 阳性率(77.42%，24/31)
2、明显高于正常对照组（2=77.84，P0.05） 。10 例 HHV6 阳性药疹病人全部为HHV6A 亚型，未检测到 HHV6B 亚型；而正常对照组 73 例HHV6 阳性标本中有 13 例为 HHV6A 亚型。药疹病人 EBV VCAIgM 阳性率（19.34% ，6/31）与正常对照组比较差异具有显著意义(2=4.61，P0.05） 。10 例 HHV6 阳性药疹病人中有 9例检出 EBV DNA，5 例 BZLF1 mRNA 阳性病人中有 4 例检出HHV6 DNA，药疹病人 BZLF1 mRNA 检出率与 HHV6 有明显的相关性（r=0.45 ，P0.05） 。结论 药疹病人存在 E
3、BV 的活动性感染，且 EBV 和 HHV6 可能有相互激活作用。 2【关键词】 药疹；疱疹病毒 4 型, 人；疱疹病毒 6 型,人 ABSTRACT Objective To study the role of EpsteinBarr virus (EBV) and Human Herpesvirus 6 infection in drugeruption patients. Methods EBV DNA was tested in druperuption patients and normal control by PCRSouthern blotting, and HHV6 DNA
4、by nestedpolymerase chain reation, the positive samples were then genotyped,the EBV VCAIgM was tested by ELISA. The expression of BZLF1 mRNA was tested by RTPCRSouthern in EBV positive samples. Results The positive rate of EBV DNA (24/31,77.42%) in the patients was higher than the normal control (2=
5、77.84,P0.05). In 10 HHV6positive patients, all were HHV6A subtype, no HHV6B subtype was found; but in 73 positive cases of the normal control, HHV6A subtype was noted in 13. The positive rate of EBV VCAIgM in the patients was 19.34% (6/31), the difference was significant as compared with the normal
6、control (2=4.61,P0.05). In 10 HHV6 positive patients, nine were detected to have EBV DNA; in five with BZLF1 mRNA positive, four were noted with HHV6 DNA, the detection rate of BZLF1 mRNA was dramatically correlated with HHV6 (r=0.45,P0.05). Conclusion There is an active 3infection of EBV in patient
7、s with drug rash, a reciprocal activation may exist EBV and HHV6. KEY WORDS Drug eruption; Herpesvirus 4, human; Herpesvirus 6, human 药疹又称为药物性皮炎，轻者仅有皮疹，重者可并发肝、肾、肺、心血管以及血液系统等损害。药疹的发病机制比较复杂，影响药疹发病的因素决定了药疹的发生、临床表现和转归。近年来药疹的病毒感染因素受到高度重视，活动性病毒感染可改变机体的免疫调节功能，提高免疫系统的免疫敏感性。研究表明，潜在的病毒感染可以启动或激活药物诱导的超敏反应。人疱疹病毒
8、 6 型（HHV6）和 EB 病毒（ EBV）均为嗜淋巴细胞疱疹病毒，可在体内形成潜伏感染，一定条件下可被激活，造成免疫功能紊乱，可能在药物超敏反应综合征中起着重要的作用1,2。本研究旨在探讨 EBV 和 HHV6 感染在药疹发生中的作用以及两者间的相互关系。 1 对象与方法 1.1 对象 药疹病人 31 例，其中男 16 例，女 15 例，平均年龄(42.4815.46)岁，全部病人均有明确的服药史，在服药 219 d（平均 4.94 d）后出现皮疹，均符合药疹的诊断和分型标准3 。选择同期健康献血员 148 例作为对照组，其中男 81 例，女 67 例，平均年龄 （42.1215.04）岁
9、，两组性别和年龄差异无统计学意义。41.2 方法 1.2.1 标本处理 取 4 mL 静脉血 EDTA 抗凝后梯度离心法分离外周血单个核细胞，用酚 氯仿 异戊醇抽提法提取细胞DNA，TRIZol 一步法提取细胞总 RNA，定量备用。 1.2.2 引物和探针的设计合成 参考文献4 6设计检测 EBV 和HHV6 基因组以及 EBV 即刻早期基因 BZLF1 mRNA 的特异性引物，由大连宝生物工程有限公司合成，引物和探针序列见表 1。表 1 PCR 检测用引物和探针序列引物序列 1.2.3 巢式 PCR（Nested PCR）检测 HHV6 DNA 采用巢式PCR 检测 HHV6 DNA，外侧
10、PCR 反应体积为 25 L，反应体系包括 10Buffer 2.5 L，MgCl2 1.5 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，上下游引物各 0.5 mol/L，Taq DNA 聚合酶 1.0 U，DNA 模板 4 L。扩增条件为：94 预变性 5 min；然后，94 30 s，58 30 s，72 45 s，扩增 35 个循环；最后 72 延伸 5 min。以外侧引物的 PCR 产物为模板进行内侧 PCR 扩增反应，内侧 PCR 反应体积 25 L，反应体系包括 10Buffer 3 L，MgCl2 终浓度 1.5 mmol/L，4dNTP 为 0.2 mmol/L，Taq DN
11、A 聚合酶 1 U，内侧引物浓度 0.5 mol/L，外侧 PCR 产物 2 L。扩增条件为：94 预变性 5 min；然后，94 变性 30 s，56复性 30 s，72 延伸45 s，共 35 个循环；最后 72 延伸 5 min。取 8 L 内侧 PCR 产物于含溴化乙锭的琼脂糖凝胶中电泳，凝胶成像系统观察电泳结果，外侧 PCR 扩增产物长为 287 bp，内侧 PCR 扩增产物长为 163 5bp，同时以 HHV6 GS 株为阳性对照，阴性对照为 HHV6 阴性JJhan 细胞系。 1.2.4 HHV6 的 PCR 产物酶切分型 取 HHV6 内侧 PCR 阳性扩增产物（163 bp）
12、用限制性内切酶 Hind进行酶切分析。反应体积为 20 L，反应体系包括 10Buffer 2 L，PCR 产物 10 L，Hind10 U，去离子水补充体积至 20 L，置 37 水浴消化1216 h。取酶切产物 10 L 于 120 g/L 聚丙烯酰胺凝胶进行垂直电泳（80 V，90 min） ，凝胶用溴化乙锭（ 0.5 mg/L）染色 20 min，凝胶成像系统观察电泳结果。 1.2.5 EBV VCAIgM 抗体检测 采集受检者外周血的分离血清，采用 ELISA 法检测 EBV 衣壳抗原（VCA）特异性 IgM 抗体，诊断试剂盒购自德国 NOVATEC 公司。具体方法参照试剂盒说明进行
13、，对阳性标本进行重复实验。 1.2.6 PCRSouthern 检测 EBV DNA PCR 反应总体积为 25 L，反应体系为：10Buffer 2.5 L，MgCl2 1.5 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，上下游引物各 0.5 mol/L，Taq DNA 聚合酶 1.0 U，DNA 模板 3 L，同时设立阳性对照和阴性对照，阳性对照为EBV 阳性细胞系 B958，阴性对照为 EBV 阴性细胞系 Ramos 细胞。扩增条件为：94 预变性 5 min；然后，94 30 s， 55 30 s， 72 45 s，共扩增 35 个循环；最后 72 延伸 5 min。取扩增产物 10
14、 L 以 20 g/L 琼脂糖凝胶电泳后转印到尼龙膜上，与地高辛标记的寡核苷酸探针进行杂交反应，经碱性磷酸酶标记的抗地6高辛抗体作用后，加酶的发光底物 CSPD 作用 5 min，自显影检测杂交信号。 1.2.7 RTPCRSouthern 法检测 BZLF1 mRNA 取 1 g 制备的总 RNA，按逆转录试剂盒要求（美国 Promega 公司）合成 cDNA作为 PCR 反应的模板。PCR 阳性对照为 EBV 阳性的淋巴母细胞系细胞，阴性对照为 EBV 阴性 Ramos 细胞系。取 PCR 扩增产物电泳后转膜进行膜上杂交，方法同上。 1.2.8 统计学方法 采用 SPSS 软件进行统计处理
15、，组间比较采用四格表 2 检验及精确概率法。 2 结 果 2.1 EBV DNA 和 HHV6 DNA 检测 药疹病人 EBV DNA 阳性率为 77.42%（24/31） ，对照组为9.46%（14/148） ，两组比较差异有显著性（2=77.84，P0.05） 。 2.2 HHV6 PCR 产物的限制性酶切分析 HHV6 内侧 PCR 产物大小为 163 bp，酶切产物电泳后若观察到长 66 bp 和 97 bp 两条带者为 6A 亚型；而 HHV6 B 则不被 Hind 消化，仍为长 163 bp 的内侧 PCR 扩增产物条带，图 2 为 HHV6阳性标本 PCR 产物酶切后电泳结果。10 例 HHV6 阳性的药疹病人7全部为 HHV6A 亚型，未检测到 HHV6B 亚型；而正常对照组 73例 HHV6 阳性标本中有 13 例为 HHV6A 亚型(13/73)。 2.3 EBV 增殖期基因表达和 HHV6 感染的相关性分析 本文 EBV
