《荧光原位杂交技术检测滑膜肉瘤SS18基因易位的诊断价值》由会员分享，可在线阅读，更多相关《荧光原位杂交技术检测滑膜肉瘤SS18基因易位的诊断价值（11页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1荧光原位杂交技术检测滑膜肉瘤 SS18 基因易位的诊断价值王芳 邵琼 张旭 吴秋良 匡亚玲 邵建永【摘要 】 【目的】 探讨荧光原位杂交(FISH) 技术检测石蜡包埋滑膜肉瘤组织中染色体易位的病理学辅助诊断意义?【方法】 收集168 例肿瘤标本,其中 75 例确诊滑膜肉瘤?33 例疑似滑膜肉瘤,采用LSI SS18 (18ql1.2)双色断裂分离探针检测 SS18 基因易位状况;60例非滑膜肉瘤作为阴性对照,制定 SS18 基因易位阳性的判断阈值?【结果】 165 例肿瘤标本成功进行 FISH 检测,其中 129 例(78.2%)SS18 基因二体性,36 例(21.8%)SS18 基因多拷
2、贝数 ?根据建立的SS18 基因易位阳性的判断阈值,确诊滑膜肉瘤的病例中85.1%(63/74)可检测到 SS18 基因易位, 余 11 例结合形态学及免疫组化结果仍诊断为 SS;疑似滑膜肉瘤的病例中 71.1%(22/31)可检测到阳性结果,余 9 例最终诊断为其他肿瘤?【结论】 FISH 法检测SS18 基因易位是滑膜肉瘤诊断的有效辅助手段 ,滑膜肉瘤的最终诊断及鉴别诊断需结合形态学?免疫组化及分子生物学检测的综合分析? 【关键词】 肉瘤; 滑膜; 原位杂交; 荧光 ; 诊断2Abstract: 【Objective】 To assess the value of molecular ge
3、netics detection of SS18 rearrangement for the diagnosis of synovial sarcoma (SS). 【Methods】 Interphase FISH with a LSI SS18 (18ql1.2) dual color, break apart probe was utilized in 168 soft tissue tumor specimens including 75 SS in the primary diagnosis, 33 potential SS and 60 non-SS. 【Results】 FISH
4、 was available in 165 specimens involved diploid of SS18 gene in 129 cases and multiple copies in 36 ones. According to the cutoff value based on non-SS, 85.1% (63/74) of SS in the primary diagnosis and 71.0% (22/31) of potential SS were considered to be positive for SS18 gene rearrangement. Combine
5、d with morphological feature and immunohistochemical results, eleven cases in SS and nine cases in potential SS, negative for SS18 rearrangement, were finally diagnosed with SS and other groups of tumor, respectively. 【Conclusions】 The break-apart interphase FISH test is a powerful aid for diagnosin
6、g synovial sarcoma, but results must be intrpreted in the light of morphological features and immunohistochemical data.Key words: sarcoma; synovial; in situ hybridization; fluorescence; diagnosis3结肠癌是人类主要的恶性肿瘤之一1,严重威胁着人类的健康?目前结肠癌的发生机制以及有效的抗肿瘤治疗研究通常是在利用人结肠癌细胞株建立裸鼠移植瘤动物模型上进行?而直接利用临床新鲜病例标本构建动物模型并观察动物模型
7、成瘤率的研究报道较少见?本实验将临床背景明确的新鲜结肠癌组织接种于 NOD-Scid 小鼠和BALB/C 裸小鼠的颈后肩胛皮下, 通过对两种品系免疫缺陷小鼠皮下移植瘤的病例成瘤率的观察,进一步了解结肠癌生长特点,从而建立背景清楚的结肠癌动物皮下实体瘤模型,提高瘤株成瘤率,为进一步研究结肠癌发病机理和防治策略奠定基础?1 材料与方法1.1 材 料选用 2007 年 10 月至 2008 年 5 月期间,经临床病理确诊为结肠癌的临床病例标本 12 例,人结肠癌标本均来源于广东省人民医院; RPMI1640(含谷氨酰,GIBCO 公司); 胎牛血清(fetal calf serum, FCS) (C
8、ostar 公司) ;胰蛋白酶(Amresco 公司);NOD-Scid 小鼠,6 8 周;BALB/C 裸小鼠,5 6 周; SPF 级, 体质量 18 22 g,雌雄兼用, 购于北京维通利华实验动物中心?中山大学实验动物中心 (动物质量合格证号:0144801?0144566?0053646 等),动物饲养在中山大学4实验动物中心屏障环境动物实验室(动物实验设施使用证明号:0042645?0042646),饲料?饮水?垫料均高温灭菌,动物自由饮食?1.2 方 法1.2.1动物皮下实体瘤模型的建立从医院手术台上切除患者结肠癌标本之后,立即放入含 10 U/L 青霉素?10 万 U/L 链霉素
9、?无小牛血清的 RPMI 1640 培养基溶液中,用冰盒送往实验室?在净化工作台上,选取肉眼观察生长良好的新鲜组织块,用含用 5 倍双抗的生理盐水冲洗 3 次,然后将组织剪成约 3 mm3 mm 大小的组织块备用1?选用 NOD-Scid 小鼠作为第 1 代?第 2 代肿瘤组织接种对象,第 3 代以后选用 NOD-Scid 小鼠和 BALB/C 裸小鼠?用乙醚吸入麻醉法麻醉动物,备皮或并消毒小鼠的右侧肩胛皮肤,把剪好的肿瘤组织块移植于第一代(原代)NOD-Scid 小鼠的消毒部位的皮下 ,每例每次接种 5 只动物;当第 1 代肿瘤生长至直径约 10 15 mm 时,选其中1 只皮下肿瘤组织良好
10、的动物,用颈椎脱臼法将动物处死 ,无菌手术把肿块剥离下来,去除其表面的结缔组织, 把肿瘤组织剪成约 3 mm 3 mm 大小的块状,用上述的方法转接于 NOD-Scid 小鼠的右侧颈后肩胛皮下作为第 2 代荷瘤鼠 ;第 3 5 代的肿瘤组织体内传代同时选用 NOD-Scid 小鼠和 BALB/C 裸小鼠, 分成 2 组,每组 5 只动物,接种方法与上述相同,如此连续进行皮下接种至第 5 代; 观察每个病例每代肿瘤组织在两种品系动物的皮下移植瘤生长情况?51.2.2 观察指标 大体观察各个品系动物每代皮下移植瘤形态? 肿瘤大小以及有否转移;病例标本在两种动物体内的成瘤率;常规 HE 染色和 CD
11、X-2(caudal type ho-meobox transcription factor 2)?CK20(cytokeratin-20)免疫组织化学检测;瘤块组织p53(mutant type p53)的鉴定, 突变型 p53 蛋白主要表达于细胞核,呈棕黄色颗粒?p53 蛋白过表达的判定标准: p53 以肿瘤细胞不着色75%(+)?2 结 果2.1 移植瘤大体观察每次接种结肠癌组织后,每 2 日观察 1 次,接种部位未出现红肿等情况?本实验发现结肠癌组织 NOD-Scid 小鼠皮下瘤第 1 代的肿瘤组织生长缓慢,一般要在 20 30 d 才长成直径约 5 mm 左右的肿块; 第 3 代到第
12、 5 代的肿瘤组织在接种后 10 15 d 在 NOD-Scid小鼠和 BALB/C 裸小鼠组均可看到约 5 mm 左右隆起的包块;同时发现 NOD-Scid 小鼠组皮下瘤比 BALB/C 裸小鼠组的生长快 (图 1)?每代皮下移植瘤模型观察 40 d 左右,移植瘤呈结节性膨胀性生长,处死6动物进行大体解剖,肉眼观察在两种品系动物的肿瘤周围的淋巴结及其它器官未见明显的转移病灶;动物摄食正常,活动状况良好,无中途死亡?2.2 病例标本的成瘤率NOD-Scid 小鼠组建立的皮下移植瘤成瘤率比 BALB/C 裸小鼠组的高?NOD-Scid 小鼠 F2 代的皮下成瘤率为 100%(12/12);F3代
13、为 92%(11/12)?F5 代为 58%(7/12);BALB/C 裸小鼠组 F3 代的成瘤率为 75%(9/12)?F5 代为 50%(6/12),具体见表 1?2.3 常规 HE 和 CDX-2?CK20 和 P53 染色观察在转种 F3 和 F5 代肿瘤组织块同时 ,分别取一部分瘤块进行固定, 做常规的 HE?CDX-2?CK20 染色?HE 染色见组织细胞排列成不规则腺体状,有核分裂相( 图 2A),免疫组化 CDX-2?CK20 检测结果均呈阳性(图 2B?C) ?同时,本研究对其中一患者病例标本的第 5 代肿瘤组织块进行突变型 p53 蛋白表达的鉴定, 其结果与临床组织标本的检
14、测结果(p53 蛋白表达:+)一致呈中阳性表达(图 2D)?3 讨 论建立动物皮下肿瘤模型既可以模拟体内的肿瘤生长情况,进行7一系列的抗肿瘤药物药效及其机制的研究,又为建立体外肿瘤细胞株奠定基础?本研究将人结肠癌组织通过第 1 2 代 NOD-scid 小鼠皮下移植传代,再同时转种到第 3 5 代 NOD-scid 小鼠和 BALB/ C 裸小鼠体内,成功建立了结肠癌动物皮下实体瘤模型, 为建立背景明确的体外结肠癌细胞系和抗肿瘤药物筛选及药效学研究提供良好的基础?建立肿瘤动物模型的影响因素复杂,受实验动物品系? 健康状况?性别?年龄以及接种方法及部位?肿瘤组织的恶化程度等影响 ?本研究原代和第
15、 2 代肿瘤组织采用 NOD-scid 小鼠进行皮下接种建立皮下移植瘤,发现其皮下成瘤率为 100%;第 3 和第 5 代肿瘤组织在NOD-scid 小鼠的皮下成瘤率比 BALB/ C 裸小鼠高,可能与本研究采用中?低分化或有转移的腺癌组织有关?Bomsa 等4 研究认为 SCID 小鼠是人体肿瘤异体移植较好的动物模型?时彦胜等5也报道SCID 小鼠比 BALB/ C 裸鼠更适宜做某些肿瘤移植模型,尤其是乳腺癌原位移植动物模型?欲建立原代实体瘤动物模型, 标本成瘤率与动物的品系?年龄,动物饲养的设施环境 ?管理方法,手术时,麻醉药的选择及麻醉的时间,接种的部位等因素密切相关?SCID 小鼠是T
16、?B 淋巴细胞功能缺陷?NK 细胞及巨噬细胞功能正常的品系4; BALB/c 裸鼠为单一 T 细胞功能缺陷的动物?而 NOD-SCID 小鼠是T?B 淋巴细胞功能?NK 细胞功能缺陷,NK 细胞活性很低?无循环补体?巨噬细胞和 APC 细胞功能损害特性的动物6?因此,本研究前 28代肿瘤组织采用 6 8 周的 NOD-SCID 小鼠进行接种和传代,很大程度上提高了人类肿瘤异种移植的成功率,提高肿瘤标本的成瘤率7?NOD-SCID 小鼠和 BALB/c 裸小鼠均为免疫缺陷小鼠,其免疫能力较低, 必须饲养在 SPF 级的屏障环境里,要特别注意无菌操作和营养保证?另外, 本研究中采用皮下接种肿瘤组织 ,手术简单
