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1、1艰难梭菌细胞毒素 B 功能区的表达作者：刘红升，张清华，姜泊，蒋知新【关键词】 艰难梭菌,细胞毒素 B；克隆,分子；基因表达【关键词】 艰难梭菌，细胞毒素 B；克隆，分子；基因表达1 材料和方法1.1 材料限制性核酸内切酶， T4DNAligase 购自 New England Biolab 公司. 厌氧发生剂、脑心浸液 (干粉) 购自生物梅里埃公司(bioMerieux). 其他试剂为国产分析纯. 艰难梭菌（clostridium difficile, C.d VPI10463）从兰州生物制品研究所购买. 大肠杆菌菌株 BL21(DE3)及质粒 PET22b(+)系南方医科大学消化研究所存
2、. 1.2 方法1.2.1 目的基因的获得 C.d VPI 10463 接种于脑心浸液(BHI)培养基中，37厌氧环境中透析培养 72 h. 碱裂解法提取 C.d 基因组 DNA. 参考 Gene bank 收录的 C.d VPI 10463 基因序列，设计2引物如：sense: 5TCCGAATTCG CTTATGTCAACTAGTGAA3 EcoRI, antisense: 5GCACTCGAGTTCACTAATCACTAATTG3， XhoI. 反应条件：50 L反应体系，热启动法， 94变性 45 s, 60退火 60 s, 72延伸 150 s, 39 个循环后再延伸 10 min.
3、 10 g/L 糖凝胶电泳观察扩增结果. 1.2.2 重组质粒的构建与鉴定将酶切、纯化的目的基因、质粒PET22b(+)按 101(摩尔数) 在 T4DNAligase 作用下 16连接 12 h. 热休克法转化. 挑单个菌落，接种在选择性 LB 液体培养基中，A600 nm 值达 0.6，提取重组质粒. 重组质粒的鉴定：用 EcoRI 与XhoI 双酶切鉴定；以重组质粒为模板，进行 PCR 反应，送上海博亚公司测序. 1.2.3 目的基因表达阳性克隆菌落接种到 2 mL 选择性 LB 培养液 37, 180 r 摇菌致 A600 nm 为 0.6， 4 过夜，然后 2%转接L培养液中，培养
4、3 h 至 A600 nm 值为 0.8，加 IPTG 至终浓度为 1 mmol/，诱导后取样 . 产物进行 SDSPAGE 分析.2 结果2.1PCR 扩增的目的基因电泳分析发现在 1800 bp 左右有一条带，大小与预计相符(图 1). 3图 1 琼脂糖凝胶电泳分析产物 略2.2 重组质粒的鉴定将获得重组质粒命名为 PET22b(+)CDB3，电泳初步鉴定结果与预期相符（图 2）. 直接以 PET22b(+)CDB3 为模板进行测序, 得到的序列，与 Gene bank 记录的C.d VPI10463 的 ToxinB3 基因序列的同源性为 99%. 图 2 目的基因的 PCR 产物、重组
5、质粒和 PET22b（+）载体用 EcoRI 单酶切的图谱略2.3 重组蛋白的诱导表达经 IPTG 诱导后,120 g/L SDS PAGE分析表明,含有 PET22b(+)CDB3 宿主菌表达出 Mr 约为71.3103，与预期的蛋白大小相符，含质粒 pET 22b(+)及无质粒的细菌则无此特异条带. 在 A600 nm 值为 0.8，IPTG 终浓度为 1 mmol/L，诱导 4 h 时，重组蛋白的表达量最大，以可溶性蛋白为主，便于纯化. 凝胶自动扫描分析,其 PET22b(+)CDB3 重组蛋白占细菌周质总蛋白的 34%,可溶性表达占上清的 22.7%，包涵体占沉淀的 25.7% (图
6、3). 图 3CDB3 基因诱导表达产物的 SDSPAGE 分析略3 讨论4C.d 是肠道感染中仅次于弯曲杆菌的常见致病菌，产生的毒素 A 与毒素 B 对人体造成危害，被公认为发达国家中最重要的院内感染源之一1. 虽然口服甲硝唑或万古霉素治疗可取得较好的疗效，但目前已存在耐药及停药后复发等问题. 疫苗接种可使高危人群获得持久和较强的免疫力，是预防与控制感染的有效措施2. C.d 重组抗原的研究已见较多的报道，但多数是集中在毒素 A 上3 ，而对毒素 B 的研究则相对较少. Genth 等4的研究将毒素B 分成 3 个氨基酸片段：CDB1（氨基酸 1546） ，CDB2（氨基酸 9011750）
7、 ，CDB3（氨基酸 17512366） ，发现抗毒素 B 抗体与CDB3 可以发生强烈反应，抗 C.d 抗体既与 CDB1 又能与 CDB3 反应，CDB2 则与两抗体均不反应 . 说明 CDB3 是良好的抗原. 进一步实验发现，只有抗 CDB3 抗体才能保护完整细胞免受毒素 B 的细胞毒性，而抗 CDB1 抗体只有进入细胞内才能起保护作用 . 说明该段很有可能成为制备疫苗和诊断抗原的重要候选蛋白. 故选取了毒素B 羧基末端 CDB3 (氨基酸 17512366)进行表达，为以后的疫苗和抗原鉴定的研究建立基础. 本研究参考 C.d 国际标准株 VPI 10463 基因序列，用自行设计的 CD
8、B3 引物在 PCR 反应中表现出较高的特异性，为理想的引物序列. 在上、下游引物中分别加入 EcoRI 与 XhoI 酶切位点，保证了读码方向的正确性. 为便于下一步的表达和纯化工作又将其装入了5末端带有 His 标签的融合表达载体，酶切鉴定和测序结果显示获得了带有特异的 CDB3 基因. 蛋白电泳分析表明获得了高效表达的C.d ToxinB3 克隆株，本实验所表达的蛋白，与该基因编码的蛋白的分子质量大小是一致的，更进一步验证了克隆的目的基因的正确性. 因此,本研究为研制 C.d 重组疫苗及制备诊断试剂奠定了一定的基础.【参考文献】1Bartlett JG. Clinical practic
9、e. Antibioticassociated diarrheaJ. N Engl J Med, 2002,346(5):334-339.2SougiltzisS, KyneL, DrudyD, et al. Clostridium difficile toxoid vaccine in recurrent C.difficile associated diarrheaJ.Gastroeterology,2005,128(3):764-770.3Ward SJ, Douce G, Figueiredo D, et al. Immunogenicity of a salmonella typhi
10、murium aroA aroD vaccine expressing a nontoxic domain of Clostridium difficile toxin AJ. Infect Immun, 1999, 67(5):2145-2152. 4Genth H, Selzer J, Busch C, et al. New method to 6generate enzymatically deficient clostridium difficile toxin B as an antigen for immunizationJ. Infect Immun, 2000, 68(3): 1094-1101.
