《脐血CD34+细胞体外扩增时HOXB4基因表达的变化》由会员分享，可在线阅读，更多相关《脐血CD34+细胞体外扩增时HOXB4基因表达的变化（14页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1脐血 CD34+细胞体外扩增时 HOXB4 基因表达的变化作者：唐宇宏，费小明，沈文怡，缪扣荣，崔毓桂，汪承亚 【摘要 】 同源盒基因家族成员 HOXB4 反映原始造血干/祖细胞(PHSC/PHPC)的自我更新和增殖能力。本研究采用实时定量 RT-PCR 的方法在 mRNA 水平上检测 HOXB4 基因的表达，以观察体外扩增脐血 CD34+细胞自我更新的水平。结果显示：随着体外培养时间的延长，虽然 CD34+细胞数增加，但 HOXB4 表达下降；周后，HOXB4 几乎检测不到，与成熟外周血淋巴细胞表达 HOXB4 的水平相同；CD34+细胞与骨髓间充质干细胞 (BM-MSC)共培养可以减缓C
2、D34+细胞 HOXB4 表达的下降。结论：脐血 CD34+细胞体外扩增过程中自我更新能力逐渐下降。CD34+与 BM-MSC 共培养有助于减缓体外扩增的 CD34+细胞自我更新能力的丧失。 【关键词】 脐血 CD34+细胞Expression of HOXB4 in Cord Blood Progenitor Cells Expanded in vitro2Abstract HOXB4，a member of homeobox gene family，is closely related to the self-renewing and proliferative ability of pr
3、imitive hematopoietic stem/progenitor cells(PHSC/PHPC). This study was aimed to investigate the self-renewing level of cord blood progenitor cells (CBPC) expanded in vitro. The HOXB4 expression at mRNA level was assayed by using real time RT-PCR. The results indicated that as culture prolonged，the t
4、otal cells，CD34+ cells greatly increased，however the HOXB4 expression gradually declined，even down to undetectable level similar to that of mature lymphocytes. Meanwhile，it was shown that CD34+ cells co-cultured with bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC) could abate the decline of HOXB4 expres
5、sion. It is concluded that the self-renewing potential of CD34+ cells gradually decreased during expansion in vitro， co-culture with BM-MSC was helpful to CD34+ cell expansion and slowed the loss trend of its self-renewal.Key words HOXB4；cord blood CD34+ cells；ex vivo expansion；bone marrow mesenchym
6、al stem cell；real time 3RT-PCR脐血是造血干细胞(HSC)的重要来源，但脐血量有限，单份脐血HSC 往往不能满足成年患者移植的需要。因此，许多人致力于体外扩增脐血造血干/祖细胞(CBSC/CBPC) 的研究。既往研究表明，FL、TPO、SCF 等可以促使原始造血祖细胞增殖，经 2 周的培养，CD34+细胞数量增加近百倍 1-3 。我们先前采用骨髓间充质干细胞(BM-MSC)共培养，CD34+细胞比值增加更为明显4 ，但对于体外扩增的 CD34+细胞自我更新能力的水平并不清楚。最近发现同源盒基因家族成员 HOXB4 作为一类转录因子，可正性调节 HSC 的自我更新 5
7、-7 。HOXB4 在原始造血干细胞（PHSC）上高表达，随着 PHSC 向各系分化，表达水平逐渐降低，直至消失8 。因此认为： HOXB4 表达强弱能够作为一种衡量CD34+细胞自我更新能力的标志。本研究以实时定量 RT-PCR 的方法检测 HOXB4 的表达，探讨造血因子刺激的单纯培养及以 BM-MSC 为基质的体外扩增 CD34+细胞能否维持其自我更新的能力。材料和方法主要仪器和试剂4Tripure Reagent (Roche，Germay)，AWV 逆转录酶（Promega，USA ） ，TAQMAN 荧光引物探针（ Applied biosystems，USA ） ， TAQMAN
8、 PCR universal Master Mix （Applied biosystems，USA） ，ABI Prism 7000 实时定量扩增仪 （Applied biosystems，USA） ，流式细胞仪(EPIC-XL Beckman coulter，USA)、G-CSF，TPO ，SCF (Krin，Japan 惠赠) ，FL(StemCell.Tech.Inc. Canada)，Ficoll 淋巴细胞分离液 (TBG，天津)，EasySepTM CD34+ progenitor separation kit (StemCell.Tech.Inc. Canada )，6 孔培养板（
9、Nunclon，Denmark ） ，StemSpanTM 培养液（StemCell.Tech.Inc. Canada） 、小鼠 IgG1-PE，IgG1-ECD 和小鼠抗人 CD34-PE，CD45-ECD 单克隆抗体(Immunotech，France)。CD34+细胞的富集8 份脐血来自我院足月顺产健康产妇，无菌操作采集，ACD抗凝。脐血加入等量 PBS 混匀后，缓慢加入 Ficoll 上，400g 离心 30 分钟，收集单个核细胞（MNC）后，用 EasySepTM 磁珠分离出 CD34+细胞，液氮冷冻保存备用。MSC 的培养和照射处理5MSC 的培养方法参照文献9 。选第 3 或 4
10、 代的细胞进行15 Gy 的 -射线照射，按 1105/孔接种于 6 孔培养板中，置 CO2孵箱过夜，让其充分贴壁，即可与 CD34+细胞进行共培养。CD34+细胞的培养在含 TPO （100 ng/ml） 、 SCF （100 ng/ml） 、 G-CSF （100 ng/ml） 、 FL （50 ng/ml）细胞因子组合的 StemSpanTM培养液中，每份 CD34+细胞分为两组进行体外扩增培养，一组以BM-MSC 为基质，另一组无 BM-MSC，将纯化好的 CD34+细胞按2104/孔接种于上述培养液中。然后置于 37 ，5% CO2 的培养箱培养。当细胞生长密度达到 90%时进行分孔
11、传代，分别培养 7 天和 14 天，收集各孔悬浮细胞计数。CD34+细胞相对计数应用流式细胞术分析扩增后脐血细胞的细胞表面标志。被测细胞用含 1% FBS 的 PBS 缓冲液调节至 1106/ml，加入小鼠抗人CD34-PE 和 CD45-ECD 单克隆抗体在室温下避光孵育 20 分钟，用流式细胞仪检测。以小鼠 IgG1-PE 和 IgG1-ECD 标记的细胞作为阴性对照。每次分析细胞 2104 个细胞，得出 CD34+细胞的比值。6细胞总 RNA 的抽提各培养时段的 CD34+细胞，加入 Tripure，制备细胞裂解液，按照说明书进行细胞总 RNA 的抽提，采用相同方法抽提扩增前（第 0 天
12、）CD34+细胞 RNA 作为 HOXB4 表达的阳性参照或标准品，外周血淋巴细胞 RNA 作为 HOXB4 表达的阴性参照。抽提的细胞总 RNA 溶于 DEPC 处理过的去离子水中，紫外分光光度计定量，取 1l 进行 1%琼脂糖凝胶电泳，确定无降解的 RNA 才能继续进行RT-PCR。HOXB4 表达的实时定量 PCR 反应测定逆转录 cDNA 制备取被测标本以及阴性对照的细胞总 RNA 1 g，用 AMV 逆转录酶制备 cDNA，反应体系为 20 l，操作按说明书进行，cDNA产物可于-20 保存。PCR 扩增7取制备好的各样本的 cDNA 1 l （cDNA 数量级在 1-20 pg 之
13、间） ，加入 TAQMAN PCR Universal Master Mix 12.75 l、 TAQMAN 引物探针 1.25 l，再加去离子水使反应体系至 30 l，按 ABI 公司试剂说明书进行 PCR 反应。阴性对照(negative control)为成熟外周血淋巴细胞的 cDNA ，NTC (no template control )为未加模板 cDNA 的空白管，每份样品设 2 个复管。HOXB4 标准品的制备 根据 ABI 公司的说明，用体外扩增前（第 0 天）富集出的 CD34+细胞 RNA 制备 cDNA 作为 HOXB4 的标准品，逐级按 100、101 、102、103
14、 稀释 cDNA，设其相对拷贝数分别为 1104、1103、1102、1101，4 保存备用。数据的收集和统计学的处理数据由 ABI PRISM 7000 自带软件完成，通过相应的程序计算出所有标准品和样品的 Ct 值，根据标准品的 Ct 值绘制标准曲线，再由其计算出样本的相对拷贝数，利用 SPSS 软件进行统计分析。结 果CBSC 的体外扩增8在含 TPO，SCF，FL 及 G-CSF 的无血清培养液，联合 BM-MSC 共培养条件下，CD34+细胞贴在 MSC 表面生长，细胞形态好(图 1)，生长的速度较快，5 天左右密度即可达到 80%以上，以后每2 天左右就需要分孔传代；而不含 MSC
15、 的培养体系中， CD34+细胞生长的速度稍慢于共培养组，约 7 天左右细胞才融合到 80%，以后每 3- 4 天能分孔传代。因 MSC 贴壁生长，培养完毕后收集悬浮细胞，计算显示：共培养组细胞总数的增加量，在 7 天和 14 天两个时间段均要多于非共培养组（表 1） 。CD34+细胞的比值根据流式细胞仪检测(图 2)，计算得出，2 周培养后 CD34+细胞亦有较多增加(表 1)。CD34+细胞 HOXB4 的表达测定细胞总 RNA 的抽提 应用 Tripure 裂解不同培养条件下体外扩增的 CD34+细胞，抽提细胞总 RNA，经电泳后观测， 5 份体外培养细胞可见清晰的 28S，18S 条带
16、（图 3） ，说明 RNA 稳定无降解，可用于 cDNA 制备和 HOXB4 表达研究。其余 3 份标本细胞总RNA 已有部分降解，不再进行 RT-PCR 的检测。实时定量 PCR HOXB4 表达标准曲线的生成 按照 ABI 公司定量 PCR 实验步骤，我们以体外扩增前（第 0 天）的脐血 CD34+细胞的 RNA 制备成的 cDNA 作为标准品，进行定量 PCR，根据设9定的相对拷贝数和分析软件生成的一系列 Ct 值（达到荧光阈值所需要的 PCR 循环数） ，得到一条标准曲线，而样品经过相同条件的PCR 循环扩增后亦会得到一系列 Ct 值，通过标准曲线就可以得到他们所分别对应的相对拷贝数（图 4，5 ） 。标准曲线中的 HOXB4的拷贝数并非实际的表达量，而是根据第 0 天细胞设定的 HOXB4表达量为基准，由 Ct 值得到的相应值。其实际含义是如果第 0 天细胞 HOXB4 的 mRNA 表达为 104 拷贝，而样品的
