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1、1胰岛素对化疗药物 5氟尿嘧啶的增效作用及其机制【关键词】 胰岛素Insulininduced Enhancement of Chemotherapeutic Response of 5Fluorouracil and Its MechanismAbstract：Objective To observe whether insulin can induce an enhancement of chemotherapeutic response of 5fluorouracil (5Fu) on human transplantable esophageal cancer nude model
2、and study the mechanism of action. Methods The expression of cyclin D1 in tumor tissue was tested by immunohistochemistry. Murine serum insulinlike growth factor1(IGF1) and insulinlike growth factor binding protein3(IGFBP3) were determined by ELISA. Results High, medium and low dose insulin (0.09,0.
3、06,0.03u/20g) combined with 5Fu could inhibit the growth of tumor greatly(P0.05) but without severe side effects of 5Fu.Compared with control group, the expression of cyclin D1 increased 2significantly in insulin group(P0.05). Conclusion Insulin can enhance the chemotherapeutic response of 5Fu on hu
4、man transplantable esophageal cancer nude model. The increased expression of cyclin D1 plays an important role in the enhancement. The change of levels in serum IGF1 and IGFBP3 fails to elucidate the mechanism of enhancement.Key words：Insulin; 5Fluorouracil；Enhancement摘要：目的 建立裸鼠人食管癌模型，观察胰岛素是否增强5氟尿嘧啶
5、（5Fu ）对裸鼠的化疗疗效并探讨其机制。方法 免疫组织化学方法检测肿瘤组织中 Cyclin D1 的表达。ELISA 方法检测裸鼠血清中胰岛素样生长因子（IGF1 ）和胰岛素样生长因子结合蛋 3（IGFBP3 ）含量变化。结果 大中小剂量胰岛素(0.09、0.06 、0.03u/20g) 均可明显增强 5Fu的抑瘤作用(P0.05)，但并不增加 5Fu的毒副反应。胰岛素组与对照组相比，Cyclin D1 表达水平明显增多(P0.05)。结论 在裸鼠人食管癌模型中，胰岛素能增强 5Fu对裸鼠人食管癌移3植瘤的化疗疗效，Cyclin D1 表达水平增多在胰岛素增效机制中发挥着重要作用。而血清中
6、IGFI和 IGFBP3含量变化尚不能解释其增效机制。关键词：胰岛素； 5氟尿嘧啶； 增效0 引言寻找和发现能够增加肿瘤对化疗药物敏感性的化疗增效剂，使化疗药物能更大程度的提高疗效并减少毒副反应,是治疗恶性肿瘤急需解决的问题。本实验在体外实验的基础上，建立裸鼠人食管癌模型，从体内观察胰岛素对化疗药物 5氟尿嘧啶（5Fu ）的增效作用并探讨其机制。1 材料与方法1.1 实验材料1.1.1 细胞株和动物4人食管鳞癌细胞 EC109 来源于中国医学科学院肿瘤研究所，由我院肿瘤病理重点实验室传代保存。裸鼠(BALB/c 品系，8 周龄，雄性)，由中科院上海动物所裸鼠室提供。培养液均为 10%胎牛血清的
7、 RPMI 1640 液，洗涤液为 RPMI 1640 液，培养条件为 5% CO2、37培养。1.1.2 药品及试剂5Fu（10ml0.25g ） ，由上海旭东海普药业有限公司生产，批号为：040108 ；葡萄糖注射液（ 20ml10g）,由河南开封制药厂生产，批号为：031213；胰岛素注射液（10ml400 单位）由江苏万邦生化医药股份有限公司生产，批号为：0406206。1.2 实验方法1.2.1 动物实验每只鼠背部皮下注射大约 0.2ml 无菌 EC109 细胞悬液(含6.08.0106 细胞 )，接种后每 2d 用游标卡尺测量瘤体最长径 a与最短径 b，计算肿瘤体积 V=1/2ab
8、2,一周后待肿瘤体积长至约0.2cm3 后随机分为六组。每组裸鼠数为 10 只。具体处理如下：为防止低血糖的发生，每只小鼠按 0.5ml/20g 灌胃 50GS 。胰岛5素大中小剂量分别按 0.09、0.06、0.03u/20g 左侧腋下注射，5Fu按 10 mg/kg 腹腔注射，胰岛素提前 30min 给药。每天用药一次，连用 8d。末次用药后第 2d 将小鼠处死。各组动物眼眶后静脉丛取血 10l,测定红细胞(RBC)、血小板(PLT)及白细胞(WBC) 量,取出肿瘤称重,按如下公式计算抑瘤率。抑瘤率(%)=对照组平均瘤重-实验组平均瘤重/对照组平均瘤重100% 。收集血清，并将新鲜肿瘤标本
9、置液氮中保存1,2。1.2.2 用免疫组织化学法检测肿瘤组织中 Cyclin D 的表达采用免疫组化 SP 染色法，步骤按北京中山 SP 免疫组化试剂盒说明书进行。用低倍镜选择背景清晰、对比满意的区域，每张切片随机观察 10 个高倍视野，每个视野计数 100 个细胞，取其均数。并用 10的中性福尔马林固定胰腺组织，作 HE 染色。1.2.3 用 ELISA 方法检测血清中 IGF1和 IGFBP3的含量每只鼠处死前取外周血约 1ml,靜置后取上清，采用武汉博士德鼠胰岛素样生长因子 1（IGF1,BOSTER,EK0378 ）和胰岛素样生长因子结合蛋白 3（IGFBP3,BOSTER,EK038
10、7 ）检测试剂盒，具体按说明书进行。2 实验结果62.1 观察胰岛素联合 5Fu对裸鼠人食管癌模型的抑瘤作用大中小剂量胰岛素联合 5Fu均能明显增加单用 5Fu 时的抑瘤作用(P0.05)，见表 1。2.2 对毒副反应进行监测2.2.1 与对照组相比，单用 5Fu组和胰岛素+5Fu 组中，白细胞数明显下降（P0.05)，见表 2。2.2.2 用 HE 染色法观察胰腺的形态学改变,结果显示：单用5Fu 组和联合用药组间差别无统计学意义(P0.05) ，见图 1。表 1 胰岛素和 5Fu对裸鼠人食管癌肿瘤的抑制作用（略）P0.05 vs Control; P0.05 vs 5Fu alone表 2
11、 胰岛素和 5Fu对裸鼠人食管癌模型外周血象的影响（略）7P0.01 vs Control表 3 ELISA 方法检测裸鼠人食管癌模型血清中 IGF1和IGFBP3的含量（略） P0.01vs Control; P0.05 Control vs Normal mice； * Normal mice: Healthy mice (male,202g) without tumor2.3 对胰岛素增效机制进行探讨2.3.1 Cyclin D1 的阳性表达位于胞浆和胞核，对照组和胰岛素组中 Cyclin D1 的阳性表达率分别为 33%和 58%，两组对比有统计学意义(P0.05)。2.3.2 ELI
12、SA 方法检测裸鼠血清中 IGFI和 IGFBP3含量变化与正常鼠相比，对照组中小鼠血清中 IGFI 水平升高, IGFBP3水平降低(P0.05)；处理组 5FU 组和联合用药组血清中 IGFI水平明显低于对照组(P0.05)，见表 3。2.4 统计分析应用 SPSS11.0 软件进行分析，各实验组和对照组间的数据进行单因素方差分析，以 P0.05 作为有统计学意义的检验水准。3 讨论已证实：生长缓慢，生长分数低的肿瘤对化疗敏感性差；而生长快，生长分数高的肿瘤却有较好的化疗敏感性3。生长快的肿瘤细胞多处于增殖周期，分裂增殖活跃，代谢旺盛，对化疗药物敏感；而生长缓慢的恶性肿瘤较多的肿瘤细胞处于
13、非增殖周期，受细胞毒药物的影响也较小。胰岛素是一种代谢促进剂，可以提高细胞和组织的代谢水平。另一方面，它还可以促进 RNA 和 DNA 的合成，刺激正常细胞和肿瘤细胞的生长增殖，诱导肿瘤细胞进入增殖周期47。合理地使用促代谢剂胰岛素，将肿瘤细胞调整到代谢旺盛，分裂增殖活跃的状态，能够增加肿瘤组织对化疗药物的敏感性。本9实验模仿临床用药，结果显示：裸鼠人食管癌模型，胰岛素可增强5Fu的化疗效果。增效的过程毒性并不增加。这与以往的体外研究结果一致8,9。细胞周期蛋白 D 与其相应的细胞周期蛋白依赖性激酶 CDK4和 CDK6 结合形成 CDK4cyclin D1 和 CDK6cyclin D1 复
14、合体，在细胞通过 G1 期进入 S 期的过程中起着关键的作用10。本实验结果显示：受到胰岛素刺激的裸鼠实验组，其 Cyclin D1 的表达明显增多。由此推断：胰岛素是通过或者说至少是部分通过增加细胞周期蛋白 D 的表达而使大量肿瘤细胞其中包括一些 G0 期细胞迅速通过 G1 期限制点进入 S 期的。通过胰岛素的作用，使肿瘤细胞 G1期持续时间缩短，进而缩短了整个细胞增殖周期。并使更多的细胞处于细胞周期中合成代谢旺盛的 S 期，提高了肿瘤组织的代谢水平，此时加入 S 期特异性化疗药物 5Fu能够更加有效地杀伤肿瘤细胞。这可能是胰岛素发挥化疗增效作用的主要原因之一。IGF 系统及其结合蛋白与肿瘤
15、的关系是近年研究的热点,许多流行病学研究表明，循环中 IGFs 水平的升高及 IGFBP3水平的降低与前列腺癌、绝经前妇女乳腺癌、结肠癌及肺癌的发病率呈明显相关性。IGFI 和 IGFBP3在细胞生长和肿瘤形成中发挥着重要作用11。胰岛素的生物学效应类似于 IGFI,这些效应通过胰岛素受体和 IGFI受体发挥作用。许多实验资料显示 IGFI能影响细胞毒10药物的疗效并在耐药过程中发挥着重要作用。本研究中，与正常鼠相比对照组裸鼠血清中 IGFI水平升高, IGFBP3水平降低(0.05)，处理组血清中 IGFI水平明显低于对照组(P0.01)。这些结果与 Sohda M 等12 的研究一致。这说明 IGFI 水平升高IGFBP3
