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1、人类染色体标本制备及核型分析 实验三 1 掌握人类外周血细胞常规核型的标本制备方法 2 掌握胰酶法G显带的技术 3 掌握G显带核型分析的基本过程和技术 4 熟悉快速线条图的绘制 5 了解染色体自动分析系统的原理和使用方法 一 目的与要求 二 基本原理 一 染色体标本制备外周血中的淋巴细胞几乎都是处在G0期或G1期 一般情况下是不分裂的 当在培养基中加入植物血凝素 phytohemagglutinin PHA 时 这种小淋巴细胞受到刺激后转化为淋巴母细胞 并开始进行有丝分裂 经过短期培养后 用秋水仙素处理 低渗 固定 滴片和染色 就可获得大量中期分裂相的细胞 制片后可以清楚地对染色体进行观察 染
2、色体标本制作技术有下述四大发现 一 美籍华人徐道觉 1952 从助手工作中的失误发现采用蒸馏水低渗处理分裂细胞可使染色体展开 二 Tjio 1956 发现秋水仙素可使分裂的细胞停止在中期 三 LiJ G 发现PHA phytohemagglutin 植物血球凝集素 可使淋巴细胞转化为淋巴母细胞 呈分裂状态 四 标本的空气干燥法使细胞和染色体展平 这种培养方法是Moorhead于1960年建立的 在人类遗传分析中普遍采用外周血培养的方法获取分裂的细胞 进而开展临床和基础遗传学的研究 这对于遗传疾病的检出以及遗传咨询等工作发挥了重要作用 二 染色体显带 人们将用各种不同的方法 以及用不同的染料处理
3、染色体标本后 使每条染色体上出现明暗相间 或深浅不同带纹的技术称为显带技术 bandingtechnique 研究发现 人染色体标本经胰蛋白酶 Na0H 柠檬酸盐或尿素等试剂处理后 再用Giemsa染色 可使每条染色体上显示出深浅交替的横纹 这就是染色体的G带 每条染色体都有其较为恒定的带纹特征 所以G显带后 可以较为准确的识别每条染色体 并可发现染色体上较细微的结构畸变 关于G显带的机理目前有多种说法 较常见的有1 Lee等 1973 认为染色体上与DNA结合疏松的组蛋白易被胰蛋白酶分解掉 染色后这些区段成为浅带 而那些组蛋白和DNA结合牢固的区段可被染成深带 2 有人认为 染色体显带现象是
4、染色体本身存在着带的结构 比如用相差显微镜观察未染色的染色体时 就能直接观察到带的存在 用特殊方法处理后 再用染料染色 则带更加清楚 随显带方法不同 显出来的带特点也不一样 说明带的出现又与染料特异结合有关 一般认为 易着色的阳性带为含有AT多的染色体节段 相反 含GC多的染色体段则不易着色 总的来说 G显带的机理还未搞清 三 内容与操作 一 染色体G显带标本的制备1 采血 采血过程中严格执行无菌操作 2 接种 超净工作台内0 3 0 5ml轻轻水平摇动混匀 培养 5 CO2 37 5 恒温箱培养64 65小时 卡介苗注射器 5号针头 向培养瓶中加入20 g ml秋水仙素 0 01 一滴 轻轻
5、摇匀 放回温箱继续培养至68小时 4 离心 10分钟 1500转 分 弃上清液 留下沉淀物 5 低渗 6 8m1预温37 的0 075MKCl溶液 沉淀细胞重重冲散 37 水浴箱30 35分钟 6 预固定 1ml新配制的固定剂 轻轻冲打 37 水浴箱中静置5分钟 7 离心 1500转 分离心10分钟 弃上清液 6 第一次固定 固定液6 8m1 沉淀物轻轻冲打均匀 37 水浴箱中静置固定10分钟 7 第一次离心10分钟 1500转 分 弃上清液 8 重复第6 7步 9 制片 留固定液0 2ml 0 4ml 轻轻冲打制成细胞悬液 冰冻载波片 滴管口距离载玻片10 15cm 每片2 3滴 10 烤片
6、 75 烤箱烤3小时 自然冷却 11 胰酶预温 立式染色缸中磷酸缓冲液100ml 1 15MNaH2PO480 8ml KH2PO419 2ml 2 5 的胰蛋白酶原液1ml配成0 025 的工作液 37 的恒温水浴箱内预温 12 显带 不断轻轻摆动 使胰酶作用均匀 处理时间25 90秒钟左右 较陈旧标本时间适当延长 随着处理标本数量增加 胰酶逐渐消耗 胰酶作用时间逐渐延长 精确的时间自行摸索 取出标本片 立即用37 预温的生理盐水轻轻漂洗两次 去除片子上的胰酶溶液 13 染色 37 预温的Giemsa工作液染色1 2分钟 自来水冲洗 气干 14 镜检 低倍镜下选择分散良好的长度适中的分裂相转
7、换油镜观察 若染色体未出现带纹 则为显带不足 若染色体边缘发毛为显带过头 此时应根据具体情况增减胰蛋白酶处理时间重新处理一张标本 注意事项 玻片完全干后 才可置油镜下进行观察 每次显带均应做予实验处理 以决定正确的显带时间 不可盲目处理所有玻片 显带效果的判断 应多观察几个长度适中的分裂相 不能仅凭1 2个分裂相的显带效果决定下一步显带时间 二 G显带标本的核型分析 一秃二蛇三蝶飞 四象鞭炮五黑腰 六号短臂小白脸 七上八下九苗条 十号长臂三条带 十一低来十二高 十三十四十五号 三个一样一二一 十六长臂近点深 十七远端带脚镣 十八人小肚皮大 十九中间一点腰 二十头重脚底轻 二十一象葫芦瓢 二十二
8、一点Y黑腰 Xpq一肩挑 1号染色体中央着丝粒和次缢痕染色深 短臂 近侧段和中段各有一条深带 其中段深带稍宽 在处理较好的标本上 远侧段可显出2 3条淡染的深带 此臂分为3个区 近侧的深带为2区1号带 中段深带为3区1号带 长臂 次溢痕紧贴着丝粒 染色浓 其远侧为一宽的浅带 中段和远侧段各有两条深带 以中段第2深带染色较浓 中段两条深带稍靠近 此臂分为4个区 次溢痕远侧的浅带为2区1号带 中段第2深带为3区1号带 远侧段第3深带为4区1号带 一秃 2号染色体 短臂 可见4条深带 中段的两条深带稍靠近 此臂分为2个区 中段第2 3深带之间的浅带为2区1号带 长臂 可见6 7条深带 此臂分为3个区
9、 第2和第3深带之间的浅带为2区1号带 第4和第5深带之间的浅带为3区1号带 二蛇 3号染色体着丝粒染色浓 在短臂和长臂的中短各有一条明显而宽阔的浅带 短臂 一般在近侧段可见两条深带 远侧段可见3条深带 其中远侧近端部的一条较窄 且着色较淡 这是区别3号染色体短臂的显著特征 此臂分为2个区 中段浅带为2区1号带 长臂 一般在近侧段和远侧段各有一条较宽的深带 在处理较好的标本上 近侧段的深带可分为3条深带 此臂分为2个区 中段浅带为2区1号带 三蝶飞 4号染色体 短臂 可见1 2条深带 短臂只有1个区 长臂 可见均匀分布的4条深带 在处理较好的标本上 在2 3深带间还可显出一条较窄的深带 此臂分
10、为3个区 近侧段第1 2深带间的浅带为2区1号带 远侧段第3 4深带间的浅带为3区1号带 四象鞭炮 5号染色体 短臂 可见1 2条深带 其远侧的深带宽而且色浓 此臂只有1个区 长臂 近侧段有一条深带 染色较淡 中段可见3条深带 染色较浓 远侧段可见1 2条深带 近末段的一条着色较浓 此臂分为3个区 中段第2深带为2区1号带 中段第3深带与远侧段第1深带之间宽阔的浅带为3区1号带 五黑腰 6号染色体着丝粒染色浓 短臂 中段有一条明显而宽阔的浅带 近侧段和远侧段各有一条深带 近侧段的深带紧贴着丝粒 在处理较好的标本上 远侧段的深带可分为2条深带 此臂分为2个区 中段的明显而宽阔的浅带为2区1号带
11、长臂 可见5条深带 近侧的一条紧贴着丝粒 远侧段末段的一条深带窄而且着色较淡 此臂分为2个区 第2和第3深带之间的浅带为2区1号带 六号短臂小白脸 7号染色体着丝粒染色浓 短臂 有3条深带 中间的一条深带窄而且着色极淡 有时不明显 远侧近末段的深带着色浓而稍宽 宛如 瓶盖 这常常是辨别7号染色体的明显特征 此臂分为2个区 远侧深带为2区1号带 长臂 有3条明显的深带 远侧近末段的一条深带着色较淡 第2和第3深带稍接近 此臂分为3个区 近侧第1深带为2区1号带 中段的第2深带为3区1号带 七上 8号染色体 短臂 有2条深带 其间有一条较明显的浅带 这是与10号染色体相区别的主要特征 此臂分为2个
12、区 中段浅带为2区1号带 长臂 近侧段可见2 3条分界不明显的深带 远侧段有一明显而恒定的深带 此臂分为2个区 中段深带为2区1号带 八下 9号染色体着丝粒染色浓 短臂 远侧段可见两条深带 在有的标本上融合成一条深带 此臂分为2个区 近侧的第1深带为2区1号带 长臂 可见两条明显的深带 次溢痕一般不着色 在有些标本上呈现特有的狭长 颈部区 此臂分为3个区 近中段的一深带为2区1号带 远侧段的一深带为3区1号带 九苗条 10号染色体着丝粒染色浓 短臂 近中段有一条深带 此臂只有1个区 长臂 可见明显的3条深带 近侧的一条着色最浓 该长臂上的这3条明显的深带是与8号染色体相区别的一个主要特征 此臂
13、分为2个区 近侧段的第1深带为2区1号带 十号长臂三条带 11号染色体着丝粒染色浓 短臂 近中段可见一条宽的深带 在处理较好的标本上 这条深带可分为两条较窄的深带 此臂只有1个区 长臂 近侧有一条深带 紧贴着丝粒 近中段可见一条明显的较宽的深带 在这条深带与近侧深带之间有一条宽阔的浅带 在处理较好的标本上 近中段的这条较宽的深带可分成两条较窄的深带 两深带之间有一条很窄的浅带 后者虽常不明显 但却是分区上的一个界标 在有些标本上近末端处尚可见一条窄的浅色的深带 此臂分为2个区 界标即2区1号带为上述近中段两深带之间的那条很窄的浅带 十一低来 12号染色体着丝粒染色浓 短臂 中段可见一条深带 此
14、臂只有一个区 长臂 近侧有一条深带紧贴着丝粒 中段有一条宽的深带 这条深带与近侧深带之间有一条明显的浅带 但与11号染色体比较 这条浅带较窄 这是鉴别11号与12号染色体的一个主要的特征 在处理较好的标本上 中段这条较宽的深带可显出3条较窄的深带 且正中一条着色较浓 在有些标本上 远侧段还可见1 2条窄的染色较淡的深带 此臂分为2个区 中段正中着色较浓的深带为2区1号带 十二高 13号染色体着丝粒和短臂染色浓 长臂 可见4条深带 第1和第4深带较窄 染色较淡 第2和第3深带较宽 染色较浓 此臂分为3个区 第2深带为2区1号带 第3深带为3区1号带 十三十四十五号 三个一样一二一 14号染色体着
15、丝粒和短臂染色深 长臂 近中段和远侧段各有一条较明显的深带 在处理较好的标本上其近侧可显出一条深带 其中段可显出一条着色较淡的深带 此臂分为3个区 近侧第2条深带为2区1号带 远侧第4深带为3区1号带 15号染色体着丝粒和短臂染色浓 长臂 中段有一条明显的深带 染色较浓 在有的标本上其近侧段可见1 2条淡染的深带 此臂分为2个区 中段深带为2区1号带 16号染色体中央着丝粒和次缢痕染色浓 短臂 中段有一条着色较淡的深带 在有的标本上可见两条深带 此臂只有一个区 长臂 除次缢痕外有两条深带 远侧段的一条有时不明显 此臂分为2个区 中段深带为2区1号带 十六长臂近点深 17号染色体着丝粒染色浓 短
16、臂 中段有一条深带 此臂只有一个区 长臂 远侧段可见一条深带 这条深带与着丝粒相连的深带之间为一明显而宽的浅带 此臂分为2个区 上述浅带为2区1号带 十七远端带脚镣 18号染色体 短臂 一般为浅带 此臂只有一个区 长臂 近侧和远侧各有一条明显的深带 此臂分为2个区 两条带之间的浅带为2区1号带 十八人小肚皮大 19号染色体着丝粒及其周围为深带 其余均为浅带 在有的标本上其长臂近中部可显出一条着色极淡的深带 短臂和长臂均只有一个区 十九中间一点腰 20号染色体着丝粒染色浓 短臂 中部有一条明显而浓染的深带 此臂只有一个区 长臂 在远侧段可见1 2条染色较淡的深带 但有时不明显 此臂只有一个区 二十头重脚底轻 21号染色体着丝粒染色浓 比22号染色体短 其长臂近着丝粒处有一明显而宽的深带 此臂分为2个区 其深带为2区1号带 二十一象葫芦瓢 22号染色体着丝粒染色浓 比21号染色体长 在长臂上可见2条深带 近侧的一条着色浓而且紧贴着丝粒 呈点状 近中段的一条着色淡 在有的标本上不显现 此臂只有一个区 二十二一点 X染色体其长度介于7号和8号染色体之间 着丝粒有时染色淡 短臂 中段有一条明显的
