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1、细菌形态学检查及质量保证 两个分隔的世界 微生物人员的无奈标本采集不合格有些病原菌难以生长或生长周期长不是所有细菌都能做药敏试验不是所有培养出的细菌都是致病菌没有培养出细菌不代表没有感染不是所有细菌或所有药物都有判断标准临床医生不主动联系试验室人员 临床医生的抱怨苛养菌检出率低结果重复性差报告速度慢感染菌与污染菌不易区分药敏结果与治疗反应存在差 关注微生物报告时效性问题 操作最简单费用最低标本直接涂片用时最短显微镜检测结果最直观可在第一时间向临床报告镜下所见 医生根据镜检结果可作初步诊断 并以此进行针对性用药 主要内容 标本涂片制作方法常用染色方法及技巧如何阅片 标本涂片制作方法 痰液 棉签挑
2、取干酪样或脓性痰部分0 05 0 1ml 均匀涂抹成卵圆形痰膜 约2cm长 每张玻片只涂一份标本脓液 同痰涂片大便 取粘液便或血便少量均匀涂布玻片 不可过厚无菌体液 标本足量 1ml 离心或甩片集菌后涂片 3000r min15min 标本量少 直接涂片病灶组织或干酪块 先用组织研磨器磨碎后再涂片 大小厚度同痰涂片 注意丝状真菌 质量控制 涂片的厚薄以镜下见到单层细胞为宜染色结果细胞核 浆清晰 胞内吞噬物清楚可见革兰染色阴 阳性分明涂片的制备水平及染色的质量 直接影响到镜检的结果 标本染色方法及技巧 根据检测目标的不同选择最适合的染色方法 革兰染色 涂片固定待涂片干后加热固定 火焰固定时菌膜朝
3、上 以中等速度通过火焰3此即可 温度不宜过高 以防菌体蛋白变性 影响染色结果 也可用乙醇或甲醇固定 染色龙胆紫10s水洗甩干碘液10s水洗甩干脱色液10 20s水洗甩干沙黄10s水洗待干镜检油镜下观察 紫色 革兰氏阳性红色 革兰氏阴性 革兰染色注意事项 注意取材部位 涂片的厚薄 染色时间应视标本种类 涂片厚薄调整 妇科白带标本染色时间应烧延长 10s 以获得更好的染色效果 脱色不宜过度 固定不可用酒精灯直接加热 避免影响染色效果 染液用完后及时改上盖子 避免挥发 被检菌的培养条件 培养基条件 菌龄的不同影响染色效果 如培养时间过长 革兰阳性菌可能染成阴性 18 24小时为宜 某些菌存在染色困难
4、 不易脱色的情况 出现染色不均 阴阳不定 某些G b 鲍曼不动杆菌等 注意生物安全 自我防护 抗酸染色 涂片固定同革兰染色染色石碳酸复红 10min水洗甩干酸性酒精1 2min水洗甩干 必要时可重复 亚甲基蓝30s水洗待干合格的片子肉眼观察痰膜呈亮蓝色 无红色斑块镜检抗酸菌呈红色 背景及其他菌呈蓝色 抗酸染色注意事项 染色时避免玻片上的染液干燥直接涂抹的痰膜厚薄适宜 以透过痰膜看报纸上的5号字迹较模糊为适宜的厚度香柏油能溶解复红染料 使萋 尼氏染色褪色 并且容易干燥凝结 对油镜头造成伤害 故避免使用香柏油 应使用专用油镜油酸性酒精用尽 可自制5 的盐酸酒精作为脱色液有时同一个抗酸菌体上 红色的
5、深浅亦有不同 镜检时注意冬季室温过低 染色时间适当延长试剂用完后及时盖好 避免挥发注意生物安全 自我防护 墨汁染色 标本 脑脊液 离心取沉淀涂片在标本涂片处滴加1滴墨汁 加盖玻片在低倍镜下找有荚膜的菌细胞 转高倍或油镜确认结果 新型隐球菌可见宽厚透亮的荚膜 细胞壁明显 有时有出芽现象 背景黑色注意事项脑脊液与墨汁的最适比例 墨汁太多影响观察脑脊液离心后涂片 离心10 30min痰液 支气管灌洗液均可作为隐球菌的检测标本 防止漏检 乳酸酚棉蓝染色 在玻片上滴加1滴乳酸酚棉蓝染液剪一段约1cm长的透明胶带 将一端贴在棉拭子木棒的一端 形成旗帜样将胶带粘性一面按在菌落表面 将菌丝粘在胶带上并平放进入
6、染液 取下木棒 再胶带表面再滴加一滴染液 盖上盖玻片使用显微镜在低倍镜 高倍镜或油镜下观察真菌形态 科兹洛夫斯基染色 涂片 可混合大肠杆菌做对比 干燥 固定滴加2 沙黄水溶液 略加热 使之冒蒸汽 约30s 1min后水洗1 孔雀绿染液复染2 3min 也可用碱性美蓝染色1 2min吸水纸吸干后镜检结果布氏杆菌呈淡红色球杆菌 其它菌或细胞呈绿色或蓝色 六胺银染色 涂片固定染色1 高碘酸 氧化10min 流水冲洗2 铁明矾10min 流水冲洗玻片放入60 预热20min的工作液中40min左右 每5min观察一次 至涂片呈淡褐色 流水冲洗0 2 氯化金调色3 5min 流水冲洗2 硫代硫酸钠固定3
7、min 流水冲洗置60 烤箱内烤干 封片结果油镜下肺囊虫包囊呈圆形 卵圆形或不规则形 包囊呈黑色 质量控制 每天质控与标本同步进行一年一次人员比对 以当次比对职称最高人员结果为参考标准 阅片 如何阅片 标本合格与否的判定感染的确认 炎症细胞 炎症性质的鉴别 单个核 分叶核或嗜酸细胞 感染性质鉴别 细菌 真菌 螺旋体 寄生虫等 微生态失衡与否及程度 菌群失调 可疑致病菌的确认 根据微生物与炎性细胞的关系 首先判断标本合格与否 开放性标本 痰液 尿液 伤口标本等 肉眼观察 痰液粘稠 脓性 血性 根据镜下细胞种类 数量及细菌种类判断上皮细胞多 炎症细胞少 多不合格 强烈提示感染的镜下现象 吞噬现象包
8、括中性粒细胞的非特异性吞噬和巨噬细胞的特异性吞噬 与粘附区别 包裹现象有些病原微生物自身具有抗吞噬能力 荚膜 炎性细胞不能将其吞噬 而是包裹起来 形成脓球 伴行现象未被炎性细胞包裹的病原菌分布在炎性细胞周围 需与污染菌鉴别 建议 对大家公认有临床致病意义的细菌 结核分枝杆菌 非结核分枝杆菌 奴卡菌 白喉棒状杆菌 隐球菌等一经检出应立刻报临床 对来自无菌部位的标本并排除污染的镜下细菌一经检出立刻报临床 呼吸道及其他污染部位的条件致病菌 肺炎链球菌 嗜血杆菌 卡他莫拉菌铜绿假单胞菌 不动杆菌等 需结合镜下涂片及病人临床信息判断是否为致病菌 直接涂片镜下观察白细胞内吞噬细菌与感染相关度高粘液丝缠绕或包裹的细菌可能为目的菌未发现吞噬现象可结合标本类型 质量 细菌是否有荚膜 菌群改变或异位大量定植等分析 谢谢
