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1、狂犬病病毒实验室检测方法摘要：狂犬病（Rabies）是一种重要的人兽共患传染病，由狂犬病病毒（Rabies virus，RV）感染温血动物和人后引起，近年来又有感染上升的趋势。一种准确、灵敏、快速的实验室检测诊断方法就显得极为重要。现就酶联免疫吸附试验（ELISA） 、荧光抗体方法（FAT） 、快速荧光抑制灶技术（ RFFIT） 、反转录聚合酶链反应（RT-PCR） 、荧光定量 RT-PCR，基因芯片技术和恒温扩增技术等狂犬病病毒实验室诊断方法做一综述。关键词：狂犬病 狂犬病病毒 检测方法狂犬病（Rabies）是一种重要的人兽共患传染病，由狂犬病病毒（Rabies virus，RV ）感染温血
2、动物和人后引起，以恐水、畏光、吞咽困难、狂躁、急性致死性脑脊髓炎，进行性麻痹和最终死亡为主要临床特征。RV 可感染多种温血动物引起死亡，表现为高度嗜神经性。脑组织感染 RV 后遭到破坏，使得狂犬病感染的病死率几乎 100%。据 WHO 数据显示狂犬病在全世界 150 个国家和地区出现过狂犬病病例。尽管狂犬病可以通过疫苗免疫进行预防，全世界每年仍有超过 5.5 万人死于该病，主要集中在亚、非、拉等发展中国家 1。中国狂犬病疫情较严重，居世界第 2 位 23，近年来，狂犬病疫情呈现回升的趋势 4。检测狂犬病抗原抗体、分析狂犬病的流行特点，并建立高效、快速、可靠的实验室检测方法可以有效控制此病的流行
3、。下面主要针对 RV 的形态特征和分子结构及主要的检测技术进行概述。1、狂犬病病毒形态特征RV 属于弹状病毒科（Rhabdoviridae ）狂犬病病毒属（ Lyssavirus）血清/ 基因 1 型，单股负链 RNA 病毒。电镜下观察病毒粒子直径为 7080nm，长160240nm，一端钝圆，另一端平凹，整体呈子弹状 5。病毒有双层脂质外膜，其外面镶嵌有 1072-1900 个 8-10nm 长的纤突(spike)，为糖蛋白，每个糖蛋白呈同源三聚体形式，电镜还显示了糖蛋白具有“头”和“茎”结构。病毒双层脂质包膜的内侧主要是膜蛋白，亦称基质蛋白(Matrix，简称 M)，是狂犬病毒的最小结构蛋
4、白。病毒的中央核心是一个直径为 40nm 的核衣壳，核衣壳(Nucleocaps)由病毒核酸 (-ssRNA)和紧密包在其外面的蛋白组成，呈紧密的连续性螺旋形式，它充满在由脂蛋白外壳形成的空间内，有 30 一 35 个卷曲。每个病毒约有 1800 个紧密排列的核蛋白。另外两种核衣壳核心的蛋白为大转录酶蛋白或称 RNA 多聚酶(Polymerase，简称 L)和磷蛋白 (Phosphoprotein，简称 P)。N、P 和 L 三种蛋白总称为核糖核酸蛋白(Ribonueleoprotein，简称 RNP)6。2、狂犬病病毒基因组结构 RV 基因组为不分节段的单股负链 RNA，分子质量约为 4.6
5、106，大小约为 12kb，由 7 个功能区组成，包括 3先导区、5 个连续的结构基因和 5非转录区。其中约 91的核苷酸为结构基因，由 3端 poly（A）5 端 AACA 依次为 N、P、 M、G、L ，其长度分别为 1421、991 、804 或 805，1675 或2059、2069，和 6429 或 6384 个核苷酸，对应的开放读码框（ (Open reading frame ,ORF）大小依次为 1353、894、609、1575 、6429 个核苷酸，分别编码核蛋白（NP） 、磷蛋白（PP ） 、基质蛋白（MP） 、糖蛋白（ GP）和依赖 RNA 的RNA 多聚酶（LP） 。在
6、狂犬病病毒 3端有一段 58 个核苷酸的先导序列，第 59位核苷酸是 N 基因 mRNA5端的起始位点,第一个开放阅读框架是第 71 位的ATG 起始密码子和第 1424 位的 TAA 终止密码子之间延伸,编码病毒的核蛋白,核蛋白基因高度保守又高效表达,可以用于狂犬病毒感染的诊断和调查。各结构基因之间的间隔区核苷酸分别为 2、5、5、423nt 7。其中 GL 之间的居间序列为伪基因，在某些类型的病毒中可以转录出第 6 个 mRNA。3、狂犬病病毒的实验室检测3.1 病毒形态学观察 电镜观察:病毒颗粒呈圆柱体，底部扁平，另一端钝圆 ,整个病毒粒子的外型呈子弹状，直径 75nm，长 130200
7、nm。表面有 10721900 个突起，排列整齐，于负染标本中表现为六边形蜂房状结构。3.2 组织病理学检测狂犬病引起的脑炎主要体现在病毒对神经的广泛侵入, 但只局限于细胞损伤10 狂犬病毒 G,N 基因的表达。组织病理学变化为一定程度的脑水肿,不存在其他特异的组织病理学变化。据 Jogai S.等 8报道,Adlochi Negri 于 1903 在狂犬病感染组织内观察到胞浆内嗜酸性包涵体,这些包涵体被命名为 Negri 小体,因此可通过检测 Negri 小体来确诊狂犬病。 Negri 小体大多出现在海马回、大脑皮质锥体细胞和浦肯也氏细胞中,较少出现在丘脑、桥脑、髓质、脊髓和感觉神经节等神经
8、组织中。组织切片及海马回、脑干、小脑新鲜组织涂片经 Sllers，苏木精-伊红，Mann 或其他物质染色后，可观察到 Negri 小体的存在。Negri 小体是典型的圆形或椭圆形有嗜碱性颗粒的嗜酸性物质 9。该方法优缺点：当组织学检查发现有狂犬病特征性病变时,通过检测内基氏小体,能达到简便、快速地确诊。然而从感染病毒的动物标本中检测 Negri 小体，只有 50% 80%的检出率。因此 ,镜检 Negri 小体, 虽然快速而且容易操作,但检测方法的敏感度不够。3.3 生物学检测3.3.1 乳鼠颅内接种分离狂犬病病毒法 此方法最初用于狂犬病的诊断是在 1935 年 10。改良后 MIT,即小鼠病
9、毒中和试验(MVNT) 被广泛用于疫苗接种动物和人的抗体检测 1112。依照 WHO 狂犬病专家委员会推荐 13,荧光抗体实验检测阴性的结果的脑样品必须再次经 MIT证实。狂犬病病毒具有较强的嗜神经性,可采用小鼠颅内接种法分离病毒后,再进行狂犬病特异性抗原的检测。MIT 具体操作方法为: 采集脑或唾液腺等病料加缓冲盐水研磨成 10%乳剂,无菌处理后离心,取上清液脑内接种 57 日龄乳鼠,性别、品种不限，每只 0. 03 mL,每份标本接种 46 只。乳鼠在接种后继续由母鼠同窝哺养, 34 d 后如发现哺乳减少,痉挛,麻痹死亡,即可取脑检查包涵体。如经 7 d 仍不发病,可杀死其中 2 只,剖取
10、鼠脑作成悬液,如上传代。如第二代仍不发病,可再传代。连续盲传三代总计观察 4 周而仍不发病者,作阴性结果报告。也可应用 3周龄以内的幼鼠,如上作脑内接种。可疑动物脑组织或唾液腺组织可用于病毒的分离,从流行病学角度考虑,检查唾液腺中的病毒更为重要,但脑组织的病毒检出率更高。在欧、美等发达国家,小鼠接种试验逐渐被细胞培养所取代,但小鼠接种试验仍然是发展中国家用以确诊狂犬病的重要检测方法。MIT 方法优缺点：小鼠接种试验敏感，准确率高，适于不具备组织培养条件的实验室检测、分离狂犬病病毒,但耗时较长,仅凭动物发病症状不足以确定为狂犬病病毒感染,常常需要配合免疫荧光法（见下文）作特异性鉴定。3.3.2
11、细胞培养分离技术 20 世纪 70 年代中期以来,各实验室相继用地鼠肾传代细胞(BHK-21)、鸡胚细胞、鼠成神经细胞瘤细胞(NAC1300)、鼠神经瘤细胞(MNa)和其他传代或原代细胞系分离狂犬病病毒街毒。CIT 技术逐渐取代了 MIT，是因为 CIT 技术费用较低，敏感、易于操作，与 MIT 相比所需时间大大缩短，即从 MIT 的 30 天缩短到 RTCIT 的 4 天 14。有研究表明,MNa 和 NAC1300 细胞分离街毒的敏感性并不低于 MIT 法 1516，如果接种物中含有少量的街毒,颅内接种小鼠,仅有 50%的分离率,而用 CIT 检出达 99%,但 BHK-21 细胞分离街毒
12、的敏感性较 MNa 和NAC1300 细胞低。一般来讲,在细胞培养中,感染狂犬病毒的细胞不出现明显的细胞病变(cytoPathiceffect,cPE),但可在接种 35 天时 ,通过免疫荧光染色（见下文）来检测狂犬病毒是否存在.当病料样品如唾液、脑脊液中所含病毒量很少时,则需要延长培养时间或进行传代培养 17。该方法的优缺点:周期短、敏感、成本低,适合大量样本的检测 ;但本方法需配合免疫荧光进行特异性诊断,需在具备组织培养条件的实验室中进行;样品严重污染细菌或腐败致使样品中病毒失活,会导致病毒分离失败。3 .4 狂犬病病毒抗原抗体检测3.4.1 荧光抗体试验荧光抗体实验(Fluorescen
13、t Antibody Test, FAT) 狂犬病病毒感染的细胞内有由狂犬病病毒核衣壳聚集形成的包含体。据 Dean DJ.等 18报道, 荧光抗体试验于 1958 年开始应用,且在 20 世纪 70 年代用作狂犬病诊断的常规方法。目前利用荧光抗体实验对抗原进行检测的方法已经渐渐取代了对包含体的检测，该方法是狂犬病参考实验室诊断最常用、最精确、快速和最可靠的方法 19。FAT 操作方法为:脑或神经组织印片、涂片或冰冻切片,与经过异硫氰酸荧光素标记的狂犬病病毒抗血清或免疫球蛋白相互作用,然后在荧光显微镜下进行检查,狂犬病病毒阳性标本中分布有大量的黄绿色荧光颗粒,呈不同的形状和大小,较大的圆形或椭
14、圆形发出强烈荧光者为 Negri 小体,沙粒或细小的灰尘荧光粒子及丝状荧光物 ,则为神经元或树突中含有的狂犬病病毒颗粒,荧光颗粒大小范围为 0. 2427Lm。以多克隆抗体为基础建立的 FAT,其敏感性及特异性不及 MIT,但是,如果利用单克隆抗体,可以增加本方法的特异性,并能区别狂犬病病毒和其他的狂犬病病毒属成员 2021。荧光抗体试验的优缺点：耗时短,整个荧光抗体试验操作仅需 30min,若加上涂片、固定,得出结果仅需 12 h; 敏感性和特异性好; 但是需要荧光显微镜、高质量的荧光标记抗体，以及具有良好素养的技术员。3.4.2 免疫组织化学上个世纪 80 年代以来,应用各种类型的免疫组织
15、化学方法,在用福尔马林固定病理标本的切片上进行狂犬病毒病毒抗原检测,用以研究狂犬病毒病毒致病机理以及人和动物狂犬病的诊断研究上 222324252627。它是以狂犬病特异性单克隆抗体和多克隆抗体作为一抗(Primary antibodies),以过氧化酶或亲和素-生物素蛋白标记的种属特异性抗体为二抗(secondary antibodies)。研究结果表明, 该方法的敏感度与 FAT 相同或更高,高于 Negri 小体组织学检测方法。其它报道也证明过氧化酶标记的方法能获得更好的检测结果 28曾经有报道,使用亲和素-生物素复合物(Avidin-biotin complex,ABC)和过氧物酶-抗
16、氧化物酶(Peroxidase-antiperoxidase,PAP)结合操作,这两种方法可迅速增强酶促反应，进一步提高其敏感度。直接免疫过氧化物酶技术或者 ABC 和 PAP 系统的优缺点：可以用福尔马林固定的标本作为检测的材料,并且还有相对简单,对材料的处理容易、风险较小等优点 29。然而这些方法的操作过程耗时较长，所需的试剂和仪器相对较贵,而且某些试剂有毒或具有致癌性，因而并没有被广泛应用。3.4.3 酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA) 最初应用于免疫后动物和人血清中抗狂犬病毒抗体的效价滴定,后来经改进也应用于狂犬病抗原检测。可通过检测脑组织中的狂犬病病毒核衣壳做出诊断。该方法 1986年由 Perrin P 建立,其敏感性及特异性与 FAT 有很好的相关性(96%), 灵敏度略低于 FAT
