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1、入门Imageproplus（IPP）的主要用途是分析测量图象。本人使用该程序进行生物图象分析有一段时间，写此帖的主要目的还是与大家交流使用心得，并总结一下使用方法。 如果你是刚接触 IPP，最好先从本帖看起，并同时打开你电脑上的 IPP 程序照着操作。学会一个软件需要花一段时间的，两分钟不可能学会。两小时也太短。但我相信，照着我这几个帖子作下来，至少是可以用 IPP 干一点事情了。打开 IPP 后的界面是这样的，该从何处下手呢？既然是处理图片，当然是先要打开一张要处理的图片嘛这张照片中的黄色部分是免疫组化染色的阳性表达成分。处理目标是通过测量图片中黄色部分的黄度来反映相应蛋白表达的的 “量”
2、 。对该图片进行观察，可以看到图片中主要有三种主要颜色，一是染成蓝色的细胞核，二是呈现出黄色的胞浆，三是细胞间的空隙区域，呈现出浅蓝色，是为背景。所以首先要把图片中呈现黄色的区域给挑选出来，这部分区域是我们最感兴趣的地方，叫作 AOI（area of interest） 。AOI 是 IPP 中最有用最重要的概念。如何能够准确地选取 AOI 就是使用 IPP 的关键操作。一旦准确地选取了 AOI，下面的测量分析就好办了。对不同的图片，需灵活地使用各种适当的 AOI 工具，就这张图片来说，AOI 是黄色区域，因此用颜色分类的 AOI 工具是最有效的。点击 measure-count/size,弹
3、出分类测量窗口。 在窗口中选中 manual，再点击 select color，弹出颜色选择窗口 segmentation，这个工具是IPP 最有特色的颜色选取工具之一。用好这个工具是使用 IPP 的要点于目标颜色鲜明的图片，用吸管工具是最简单的。点一下吸管图标，在目标区域点一下，就可以选中该点的颜色，当然一下是不可能完全选中所需要指定的全部区域，可以在未选中的地方接着再点，这样多次选取，直到把想选中的区域全部选中为止。在这张示例图中，选中的蓝色细胞核部分被标上了红色。用红框圈起来的四个工具按纽分别是：吸管、撒消上一步操作、橡皮擦、全部清除。下在的小方框里则是吸管位置的选取颜色。图片中被标上红
4、色的区域被定义为一个 class，其中每一个独立的小区块被定义为这个 class中的一个 object。以此图为例，图中深蓝色的部分是细胞核，因此所有的细胞核都被选中成一个 class，其中每一个细胞核就是一个 object。选取完 AOI 后，点击 close 回到 count/size 窗口，下一步就可以对选中的 object 进行测量操作了。点击 count/size 窗口中的 measure 菜单，点 select measure，这是选择要进行何种测量操作，在弹出的测量选择窗口左侧列出了各种可用的测量选项，最常用的测量有：area 面积density（mean）平均光密度diamet
5、er 直径IOD（integrated optical density）累积光密度在相应的项目上点一下，该测量项目就被选到中间的窗口中了，同时关于该测量的详细说明会显示在最右边。如果想取消某个已选中的测量项目，则在左边窗口中该项目上再点击一下就可以了。 选好了待测量的区域，也指定了测量项目，就可以进行测量统计了，点击一下测量选择窗口的 OK 纽，关闭这个窗口，就回到了 count/size 窗口，再点击一下 count 按纽，就可以看到程序在进行测量，稍等几秒钟即可读取测量数据。分别点击 count/size 窗口中 view 菜单中的 measurement data 和 statistic
6、s，就分别弹出这两个数据窗口。前者是这个 calss 中每一个 object 的测量数据，后者是这些测量数据的统计参数，如总数、平均值、累加、标准差等。本例中得到的就是每个细胞核的面积、平均光密度值、直径、累积光密度值。统计数据则可得到这张图片中所有细胞核的平均面积、平均光密度值，平均直径、累积光密度值，当然还有细胞核的数目，就是所有 object 的数目。测量数据转入 EXCEL 处理起来最方便。只要在数据菜单中点 file - DDE to EXCEL。数据就传到 EXCEL 的 sheet1 里去了。在这个示例图片的统计数据中，samples 为图中所有细胞核的个数，第一列为 area，
7、其中的Mean 值为各个核的平均面积，后面就是平均灰度、平均直径，这些是有意义的测量统计数值。但 IOD 却是 SUM 值更有意义。订正：在上述操作中漏掉了一个重要步骤，就是要转换图象 intensity 格式。在默认的 intensity 格式中，是图片灰度，越黑数值越小，越白数值越大。而实际上我们测量的染色强度是光密度，染色越深，光密度值越大。如果不进行光密度单位的转换，测量的数值将完全是错误的。转换光密度单位的方法如下：点击：measure-carliberation-intensity，调出 intensity 校正窗口。然后在窗口中点 new 按纽，再点一下下面的 std optic
8、al density 选项，这时可以看到窗口中的直线变成了反向的曲线。然后还要点一下最上面的 system 按纽。最后点 close 关闭窗口。这样就把程序系统的灰度单位转换成了光密度单位。关于光密度较正的详细内容请参见第十帖。校正光密度单位的操作要在打开第一张图片后立即进行。将光密度单位设定为 system 之后就不必再对后面的每一张照片都进行光密度校正了。整个分析测量过程就是这样。当然，光知道这一点是远远不够的。在以上所述各个步骤中有许多技巧和方法能使测量数据更加准确合理。本人将另发帖子分别详细叙述。此主题到此结束。AOI 技巧在阅读这篇帖子之前，希望你看一下入门篇，尽管入门篇里说得极其简
9、单，实际上根本就作不了实际工作，但那却是使用 IPP 的基本过程，利用以后我叙述的各种技巧，我们就可以按照这个过程准确地作出各种实际的图像分析测量了。 在 IPP 中，最有特色，最有用处的工具有两个。一个就是我们已经看过的 segmentation 工具，另一个是 irregular 工具。 我们先看 irregular 工具。 这是一个用来描绘不规则孤立对象边界的工具。图中一个个棕黄色形状是免疫组化染色的贴壁培养细胞，为了计算每个细胞的面积及蛋白表达，首先就是要选取每个细胞的边界线，这就可以用到 irregular 工具了。在工具栏上点一下那个不规则园形的按纽，就调出了irregular 工
10、具条。这个工具的标题叫 Magic wand，就是 photoshop 中的魔棒呀。将鼠标移至图中一个细胞的中间，光标就变成魔棒了，在一个位置左键点一下，就选中了这个位置及其周围灰度相似的区域。这里“相似”的定量范围由 Range 的值来决定。较大的值为较大的灰度范围，点一下能选中一大片区域，较小的 range 值则为较小的灰度范围。在一个区域上多点几下，就能选中这个区域的整个边界了。最后点一下右键，就确定了一个不规则形状的选定区域。点一下左边的问号，就能看到相应的使用说明。smooth 值是用来平滑区域边界的。一般不需要平滑，因此默认值为零选中一个区域后如果还要在同一张图片上再选另一个区域，
11、不能直接点选，要先点击一下工具栏上的 Multiple AOI 按纽，再点击 add，接下去就可以到另一个选择区域点选。选好一个新的区域后再回去点 Multiple AOI-add 确认，再继续下一个，直到选取完所有的AOI。最后在图片上任一处点一下右键结束选择操作。结束后如果又想再增加选择区域，只要再点一下 newAOI 按纽，就可以调出工具条继续增加选择区域。 这个 irregular 工具还有另一个操作方式，在问号旁边有个 trace 按纽，点一下它，工具条就变成另一个样子了。这种操作方式是沿着孤立图像的边缘寻迹，从而画出一个沿着孤立形状边缘围成的一个 AOI。第一种是手画法。确认工具条
12、右边的 Auto 选项没有打勾，将光标移至目标图形处按住左键拖出一个闭合图形，点右键结束。用鼠标画当然是不会准确的。实在没别的招了才会出此下策。第二种方法是自动寻迹。把那个 Auto 给选上，speed 值给减到 1（慢速看得清楚） ，在目标图形的边缘处左键点一下鼠标，然后沿着边缘稍移动一下鼠标后再点击一下左键，这是给程序指明一个寻迹的方向，马上就能看到光标自动沿着边界走起来了，一直会走到起点处才会停止。这样就自动围成了一个闭合区域，点一下右键就确认了这个 AOI。重复选取多个 AOI 的方法与楼上一样。如果目标图形边界清晰，那么这个工具是非常管用的。可惜的是在许多情况下边界是模糊不清的，光标
13、走到此处时会乱走一气。这时就要及时先点一下鼠标使光标暂停下来，然后在期望的方向延长再点一下左键，给程序指明一下前进的方向，如此多次，直到光标回到起点为止。最后点一下右键围成一个闭合的 AOI。围好的 AOI 边界是绿色框。 自动寻迹挺好玩吧?不过别忘了我们的目的。选好了一个个的 AOI 后当然是要测量每个区域的几何尺寸及光密度啦。下面该怎么作呢？点开 count/size 窗口，点菜单 EDIT-convert AOI to Objects。这样就把刚才选中的一个个AOI 变成了要测量的 object 了，那些小区域的颜色也由 AOI 绿色外框线变成了 object 的标记了。object 的
14、标记类型是可以自己设定的。在 count/size 窗口右边有一个 option 按纽，点开它就能设定 object 标记的外观了。在 option 窗口中，outline style 可以选 outline（轮廓线）或 filled（填充 class 颜色） 。label style 可以选择为 object 序号或测量值。再下面是 label 的文字颜色。右上角还有一个 class 的颜色选择按纽，估计大家自己试一下都会用的。 下一步是点 measure 菜单下的 select measurements。选上要测量的项目。注意，选完后要点击这个菜单中的 measure 按纽（而不是 cou
15、nt/size 窗口中的 count 按纽） 。然后是 OK 按纽关闭 measure 窗口，点开 view 菜单下的 measurement date 和 statistics 数据窗口。几个 object 的测量数据就已经在里面了。如果你还想继续增加 objcet，可以直接用 irregular 工具画 AOI，然后点 convert AOI to object。这期间把数据窗口留着不关闭，可以看到新增的 object 测量数据会立即被更新。前面讨论的主要是 irregular 工具，它对于大个的孤立图形对象的选取是有用的，而面对组织切片中密密麻麻的细胞，就得用本主题讨论的 segment
16、ation 工具了。实际上，在第一部分入门中所用的就是 segmentation 工具，在那里我用颜色吸管选取了图片中蓝色的细胞核，但是如果仔细观察一下选取的效果就会发现，有一些挨在一起的两个以上的细胞核被识别成了一个，另有一些蓝色的杂质颗粒被错误地识别成了细胞核。如果你试着用吸管工具选取一下图中黄色的免疫反应表达区域，就会发现因为黄色很浅，很不容易准确地选取。所以对于 segmentation 工具还需要有更多的应用技巧。让我们还是从打开图片并调出 count/size 窗口开始吧。对这种色彩饱和度低，各种成分颜色区别很小的图片来说，只能手工选择 AOI 了。选 manual，并点 select color 调出 segmentation 窗口。窗口里有两个表单，一个是 color cube based，另一个是 histogram based。我们要选取后者，并且使用 HSI 颜色格式来进行分色选择。当切换到 HSI 时，会弹出一个窗口提示你会 reset 颜色选择，是否
