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1、4 基因工程的操作过程,C 转化子的筛选和鉴定（检）,B 重组DNA分子的转化和扩增（转、增）,A DNA的体外重组（切、接）,4 基因工程的操作过程,切,接,转,增,检,A DNA的体外重组（切与接）,4 基因工程的操作过程,同种内切酶生产的粘性末端的连接,同尾酶生产的粘性末端的连接,重组率,同种内切酶生产的粘性末端的连接,5,5,EcoRI,退火,G,CTTAA,AATTC,G,G,CTTAA,AATTC,G,T4-DNA ligase,5,5,5,5,同尾酶生产的粘性末端的连接,BamHI,5,G,CCTAG,GATCC,G,5,5,5,GATCA,T,5,退火,G,CCTAG,GATC
2、C,G,5,GATCA,T,T4-DNA ligase,5,5,BclI,G,CCTAG,GATCC,G,5,GATCA,T,5,5,重组率,重组率的定义,重组率 = 含有外源DNA的重组分子数 / 载体分子总数 在常规实验条件下，重组率一般为25 - 75% 重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以 大大简化DNA重组的后续操作。,重组率,提高重组率的方法,提高外源DNA片段与载体的分子比：5 : 1 - 10 : 1,载体DNA分子在连接前先除去磷酸基团：,5,5,EcoRI,5,G,CTTAA p,AATTC,G,5 p,5,5,AATTC,G,5 HO,退火,5,G-A-A
3、-T-T-C,C-T-T-A-A G,5,G A-A-T-T-C,C-T-T-A-A-G,OH,HO,OH,HO,碱性磷酸单酯酶,碱性磷酸单酯酶,B 重组DNA分子的转化和扩增（转与增）,4 基因工程的操作过程,转化的原理与技术,转化率,转化细胞的扩增,转化的原理与技术,Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化,Ca2+诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌等），1970年建立此技术，其原理是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态叫做感受态,转化的原理与技术,Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化,大肠杆菌感受态细胞的制备：,
4、100 ml 菌体培养至OD600 = 0.5，离心收集菌体,用10 ml 冰冷的20 mM CaCl2溶液悬浮菌体，离心,用1 ml 冰冷的100 mM CaCl2溶液悬浮菌体,冰浴放置12 - 24小时，备用,收集菌体,转化的原理与技术,Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化,大肠杆菌感受态细胞的质粒转化：,取100 ml 感受态细胞，加入相当于50 ng 载体的重组,冰浴放置半小时,在42保温 2 分钟（热脉冲）,快速将转化细胞转移至冰浴中放置1 - 2分钟,DNA连接液，混匀,加入1 ml 新鲜培养基，于37培养 1 小时（扩增）,涂在合适的固体培养基平板上进行筛选,转化的原理与技术,细菌原
5、生质体的转化,革兰氏阳性细菌（如枯草杆菌、链霉菌等）接纳外源DNA的主要屏障是细胞壁，因而这类细菌通常采用原生质体（细胞去壁后的形态）转化的方法转移质粒或重组DNA分子,酵母菌、霉菌、植物细胞也可用原生质体法进行转化,转化的原理与技术,电穿孔转化,将待转化的质粒或DNA重组连接液加在电穿孔转化仪的样品池中，两极施加高压电场。在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内 电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞壁结构的受体细胞均有效，但转化效率差别很大 同样的原理，电穿孔法也可用于质粒消除实验,转化率,转化率的定义,转化率是衡量转化效率的重要指标，其定义为
6、：每微克载体DNA在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数。由于在一般的转化实验规模下，每个受体细胞最多只能接受一个载体分子，因此转化率的定义也可以表征为：每微克载体DNA转化后，受体细胞接纳DNA的个数，即克隆数（在筛选时，未接纳载体或重组子的受体细胞不长）,转化率,转化率的定义,例如，pUC18对大肠杆菌的转化率为108，即每微克pUC18中只有108个分子能进入受体细胞。一微克pUC18共有3.4X1011个分子（6.02X1017 / 2686X660），也就是说，每3400个pUC18分子才有一个分子进入受体细胞 另一方面，在实际操作过程中，转化一微克pUC18共需2ml感受态细胞，大约
7、含有2X1010个大肠杆菌细胞，也就是说，每200个细胞只有一个细胞能接纳pUC18 DNA,转化率,转化率的用途,利用转化率和重组率等参数可以帮助设计DNA重组实验规模,例如，某一DNA重组实验的重组率为20%，转化率为107/mg载体，,经切接处理后的载体转化率比天然的载体低100倍，欲获得104个,重组克隆，需投入多少载体DNA进行重组实验？,若重组率为100%，则转化后产生104个重组克隆需要：,104 / 107 X 10 - 2 = 0.1 mg 载体DNA,考虑到实验系统的重组率为20%，所以实际投入载体应为：,0.1 / 20% = 0.5 mg 载体DNA,载体投入量确定后，
8、外源DNA的投入量即可按101的要求算,出（5 mg），甚至还可以估算需要涂布多少块平板进行筛选,转化率,转化率的影响因素,载体及DNA重组分子方面：,载体本身的性质：,不同的载体转化同一株受体细胞，其转化率不同,载体的空间构象：,质粒的超螺旋构象转化率最高，经酶切连接操作后的载,体由于空间构象难以恢复，其转化率一般要比新制备的,超螺旋质粒低两个数量级,插入片段的大小：,对质粒载体而言，插入片段越大，转化效率越低,转化率,转化率的影响因素,受体细胞方面：,受体细胞必须与载体相匹配，例如：pBR322转化大肠杆菌JM83株，转化率很低；但对大肠杆菌ED8767株的转化率则较高,转化率,转化率的影
9、响因素,转化方法方面：,受体细胞的预处理：影响最大,供受体的比例：,Ca2+诱导转化 0.1 ml 感受态细胞 50 ng DNA,转化方法：,Ca2+诱导转化 106 - 107 / mg DNA,原生质体转化 109 个原生质体 50 ng DNA,原生质体转化 105 - 106 / mg DNA,l-DNA转染 107 - 108 / mg DNA,电穿孔转化 106 - 109 / mg DNA,转化细胞的扩增,扩增操作,转化细胞的扩增操作是指转化完成之后细胞的短时间培养。在实验时，扩增操作往往与转化操作偶联在一起，如： Ca2+诱导转化后的37培养一个小时 原生质体转化后的再生过程
10、 l噬菌体转染后的30培养等，均属扩增操作,转化细胞的扩增,扩增操作的目的,增殖转化细胞，使得有足够数量的转化细胞用于筛选程序,扩增和表达载体分子上的标记基因，便于筛选,表达外源基因，便于筛选和鉴定,C 转化子的筛选和鉴定（检）,4 基因工程的操作过程,载体遗传标记检测,克隆DNA序列检测,外源基因产物检测,C 转化子的筛选和鉴定（检）,4 基因工程的操作过程,由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借助各种筛选和鉴定方法区分转化子与非转化子、重组子与非重组子、目的重组子与非目的重组子,转化子,重组子,目的重组子,载体遗传标记检测,抗药性筛选法,ROP,ROI,Sal I,BamH I,
11、Tc,r,Pvu I,Pst I,Pst I,EcoR I,Cla I,Hind III,Hind II,Bal I,Ap,r,抗药性筛选法的基本原理：,pBR322,4363 bp,ori,抗药性筛选法可区分转化子与非,转化子、重组子与非重组子,将外源DNA片段插在EcoRI位点：,非重组子呈 Apr、Tcr,重组子呈 Apr、Tcr,将外源DNA片段插在BamHI位点：,非重组子呈 Apr、Tcr,重组子呈 Apr、Tcs,载体遗传标记检测,抗药性筛选法,抗药性筛选法的基本操作：,先将转化液涂布含有Ap的平板,再将Ap平板上的转化子影印至,含有Ap和Tc的平板上,在Ap平板上生长、但在Ap
12、和Tc,平板上不长的转化子即为,Ap,Ap + Tc,影印,挑选,重组子,载体遗传标记检测,营养缺陷型筛选法,营养缺陷型筛选法的基本原理：,营养缺陷型筛选法可以区分转化子与非转化子，一般不能区分重组子与非重组子。其原理是：载体分子上携带某种营养组份的合成基因，而受体细胞本身不能合成这一营养组份，将转化细胞涂布在不含此营养组份的培养基上，长出的便是转化子,载体遗传标记检测,营养缺陷型筛选法,常见的营养缺陷型筛选标记：,哺乳动物细胞中存在两条dTTP的合成途径：,用于大肠杆菌的营养标记基因常选用色氨酸生物合成基因trp+,用于高等哺乳动物细胞的营养标记基因常使用胸腺嘧啶核苷激,酶基因tk，相应的受
13、体细胞则选择tk-缺陷型,dCDP,dTDP,dTTP,TR,dTMP,dTDP,dTTP,AP,TK,AP 氨基喋呤,TK 胸腺嘧啶核苷激酶,载体遗传标记检测,显色筛选法,显色筛选法的基本原理：,显色筛选法可以区分转化子与非转化子，也可区分重组子与非重组子。其原理是：载体分子上携带某种显色酶基因，其表达产物能使细胞产生颜色反应，从而易于辨认和挑选，如大肠杆菌质粒pUC18携带的lacZ基因（蓝色反应）、链霉菌质粒pIJ702携带的melC基因（黑色反应）等,载体遗传标记检测,显色筛选法,显色筛选法的基本操作：,pUC18,Ap,r,lacZ,ori,Ap + X-gal,重组子（Apr +
14、lacZ-）,将外源基因克隆在pUC18的lacZ标记基因内部，使之灭活，此时重组子呈Apr、lacZ-，淡黄色菌落；而非重组子则呈Apr、lacZ+，蓝色菌落,克隆DNA序列检测,限制性酶切图谱法,所谓的限制性酶切图谱法就是对载体上插入的外源DNA片段进行酶切图谱分析，并以此与目的基因的已知图谱对比，因此利用这种方法不仅能区分重组子与非重组子，而且还能鉴定目的重组子。但这种方法在用于数千规模的转化子筛选时，工作量极大，实验成本也高。,克隆DNA序列检测,限制性酶切图谱法,全酶解图谱法：,B,B,E,P,4.0 kb,1.0 kb,0.8 kb,区分重组子与非重组子,用BamHI酶切转化子质粒DNA,电泳观察酶解产物片段,重组子： 2.7 kb + 4.0 kb,非重组子： 2.7 kb,如果外源DNA片段也是2.7 kb，最好选用单一切口的酶将质粒线型化，然,后通过其长度来鉴定其是否为重组子,克隆DNA序列检测,限制性酶切图谱法,全酶解图谱法：,S,S,B,P,4.0 kb,1.0 kb,0.8 kb,区分重组子与非重组子,如果外源DNA片段插在pUC18的SphI位点处，原则上也可用SphI酶解鉴定，但这样做很不经济，因为SphI非常昂贵（每100单位50美元）。用HindIII和EcoRI联合酶解同样可以达到目的，但这两种酶的价格只及SphI的1 / 50,
