基因诊断和治疗PPT课件

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1、1 第一节 2 3 依据DNA生物学功能 及分子遗传学中心法则 DNA 基因 在生物体蛋 白质合成中起主要作用 一定结构的基因产生一定 结构的蛋白质 一切生理 和病理现象都直接或间接 地受遗传基因控制 基因诊断的理论依据 4 u 是指运用分子生物学和分子遗传学方法对生物体 的基因组DNA片段及其转录产物进行定性和定量 分析 从而对疾病作出诊断 基因诊断的概念 分析手段 研究途径 研究目的 分子生物学 遗传学的技术和原理 1 对DNA序列分析鉴定 2 对mRNA分析定量 在DNA水平分析 鉴定遗传性疾病所涉 及基因的突变 置换 缺失或插入 5 临床诊断 基因诊断 生化学诊断 血清学诊断 临床表现

2、 DNA 转录 mRNA 翻译 细胞核 细胞膜 蛋白质 6 一 高度的特异性 二 检测灵敏度及精确性高 三 可以早期快速诊断 四 检测材料来源广 五 被检测基因不一定要处于活化状态 基因诊断的特点 7 对患者基因或DNA本 身直接进行分析 具 有高度的特异性 基 因 诊 断 临 床 诊 断 血清学诊断 生化学诊断 以疾病表型改变为依 据 非特异 出现时 间较晚 一 高度的特异性 疾 病 诊 断 8 待测标本用量少 PCR方法可以检出pg 10 12g 水平的靶基因 可从人类长达3 106kb的基因组中检测单拷 贝基因 并可检出某一基因的单碱基改变 二 检测灵敏度及精确性高 9 如结核性脑膜炎

3、常规培养鉴定需几周时间 痰涂片染色镜检阳性率低 而应用PCR方 法确诊只需一个工作日 由于人体各种组织中得到的DNA都是一样的 因此 在妊娠早期取胎儿绒毛或在妊娠中 期取羊水脱落细胞提取DNA 可进行遗传病 的产前诊断 三 可以早期快速诊断 10 机体各种组织的有核细胞均有全套基因组DNA 都可以作为分析的材料 而不必考虑表达问 题 如 珠蛋白基因 苯丙氨酸羟化酶基因 有的遗传病至今也不了解引起疾病的基因 基 因产物和生化机理 但只要有与疾病连锁的遗 传标志即可进行诊断 四 检测材料来源广 11 即使细胞中基因在静止状态时 如血斑 精液斑中的DNA 也可被测出 五 被检测基因不一定要处于活化状

4、态 12 核酸杂交 聚合酶链反应 基本技术 基因诊断的原理 基因突变 DNA缺失 插入 移码突 变 点突变 13 已知基因的 核酸序列 标记 待测的单链 基因组DNA 待测DNA中 含已知基因序列 双链DNA 含标记物 一 核酸杂交 碱基完全配对 互补结合 杂交信号检测 14 待测物中 含靶序列 二 聚合酶链反应 PCR 扩增产物检测 引物 聚合酶 dNTP MgCl2 含微量靶序列 的待测物 模板 大量目的产物 变性 退火 延伸 循环扩增 15 一 基因诊断检测的靶物 DNA 基因 分析基因的结构 mRNA 从基因表达水平分析基因的功能 基因诊断的条件 16 基因探针 高度特异性 灵敏显示系

5、统 基因组探针 cDNA探针 寡核苷酸探针 RNA探针 二 基因诊断检测的探针 探针 标记的已知序列核酸片段 包括 DNA cDNA RNA Oligonucleotide 17 基因组探针 cDNA探针 寡核苷酸探针 RNA探针 从相应的基因转录获得mRNA 再通过逆转录而获得 来自基因组DNA文库中有关的基 因片段 经克隆或PCR扩增获得 在体外人工合成碱基数不多的 与基因序列互补的DNA片段 从病毒基因中分离 通过cDNA克隆 或基因克隆经体外转录体系制备 基因诊断的方法 Method of Gene Diagnosis 第二节 18 19 基因诊断的方法 v 核酸分子杂交技术 v 聚合

6、酶链反应 PCR 技术 v 连接酶链反应 LCR v DNA序列分析 v 基因芯片技术 v 限制性片段长度多态性 RFLP 分析 20 一 核酸分子杂交技术 一 原位 in situ 杂交 二 斑点印迹 spot blot 杂交 三 Southern 印迹杂交 四 Northern 印迹杂交 21 原位 in situ 杂交 方法 不需提取DNA或RNA 直接用培养 采集 的细胞 涂载玻片上 组织切片 固定载玻片 上 和细菌菌落 复印至滤膜上 与标记核酸探 针杂交 用途 可测知特定基因的存在或表达状况 还可 观察被测基因在细胞内或染色体上的定位 优点 不必提取核酸避免了抽提中核酸量的损失 因而

7、比其他技术敏感的多 可在1 的细胞中 检出目的核酸序列 22 二 斑点印迹 Spot blot 杂交 方法 将提取的样本DNA或RNA 变性后 点样吸附 在硝酸纤维膜 NC 尼龙膜上 与探针杂交 或把细 胞 病毒点在膜上 变性后杂交 或培养的菌落 菌斑 原位吸附于膜上 变性后杂交 用途 基因组中特定基因及其表达的定性 定量分析 优点 简便 快速 可在同一张膜上同时进行多样品检测 缺点 不能鉴定所测基因的分子量 特异性不高 有一定 比例的假阳性 23 基 因 诊 断 技 术 斑 点 杂 交 点样 Probe 32P 检测 A B 1 2 3 4 24 方法 把DNA经限制性酶切割 凝胶电泳后 再

8、转移 到硝酸纤维膜或尼龙膜上 与标记核酸探针杂交 三 Southern印迹杂交 用途 用于基因组中特定的基因或序列的定性及定量 分析 也常用于鉴定克隆DNA的特殊序列 优点 既可准确保持DNA序列在电泳图谱中的位置 又可检测出哺乳动物总基因组中特异的DNA顺序片段 单拷贝基因 并测定其分子量 25 26 四 Northern印迹杂交 方法 将RNA经变性 非碱变性 及电泳分离后 转移到硝酸纤维膜或其他固相支持物上 与标记核酸探针进行杂交反应 用途 是分析基因表达水平的主要技术 可 用于组织细胞中总RNA或mRNA的定性 定 量分析 测知某一特定基因的表达情况 27 二 聚合酶链反应 PCR 技

9、术 一 DNA PCR 二 RT PCR 逆转录PCR 三 原位PCR 四 多重PCR 五 定量PCR 六 PCR SSCP 单链构象多态性 28 方法 以所需扩增的基因组DNA为模板 进行 PCR反应 经扩增的DNA片段 通过电泳分离 和染色 溴乙锭或荧光染色 后 可直接在所 显示的带谱上进行诊断 一 DNA PCR 特点 通过PCR 20 30次的循环 可使原来 需10 g的基因组DNA才能进行的单拷贝基因 的探测 减少到ng水平 29 优点 应用PCR方法 既不需Southern转移 又不必制作探针进行杂交及放射自显影等操作 且原先需要一 二周才能作出的诊断可以缩 短至数小时 故既简便又

10、经济 用途 用于检测单拷贝基因或DNA片段的存在 并常与核酸分子杂交结合 分析鉴定基因突变 一 DNA PCR 30 二 逆转录 PCR RT PCR 方法 用提取的mRNA或总RNA 含mRNA 为模板 逆转录成cDNA后 再扩增cDNA 用途 是检测特定基因表达水平的主要方法 也是用于鉴别诊断RNA病毒的重要技术 31 Reverse transcription PCR RT PCR 原理 32 三 原 位 PCR in situ PCR 方法 不需提取DNA RNA 直接用组织切片和细胞 进行PCR或RT PCR反应 特点 比原位杂交的灵敏度提高50 100倍 但扩增 效率不如液相PCR

11、 用途 在组织 细胞原位检测单拷贝或低拷贝的特定 DNA或RNA序列 既能鉴定含靶序列的细胞 又能 确定被测靶序列在细胞内或染色体上的位置 多用于 检测病原体 尤其是对于潜伏性感染的病原体 可大 大提高检出率 33 固定组织或细胞 将组织细胞固定于预先用四氟乙烯包被 的玻片上 并用多聚甲醛处理 再灭活除去细胞内源性过 氧化物酶 蛋白酶K消化处理 用60 g ml的蛋白酶K将固定好的组织 细胞片55 消化处理2h后 96 2min以灭活蛋白酶K PCR扩增 在组织细胞片上 加PCR反应液 覆盖并加液 体石蜡后 直接放在扩增仪的金属板上 进行PCR循环扩 增 有的基因扩增仪带有专门用于原位PCR的

12、装置 杂交 扩增后 用标记的寡核苷酸探针进行原位杂交 观察 显微镜观察结果 三 原 位 PCR in situ PCR 34 四 多 重 PCR 方法 在一次PCR反应中加入多对引物 同时扩 增DNA链上的不同序列段 扩增产物经琼脂糖电 泳和溴乙锭或荧光染色 即可直接在所显示的带 谱上进行诊断 用途 主要用于一些 超大 基因中大片段缺失的 分析 举例 杜氏肌营养不良症 DMD 是由于DMD 基因的9个外显子区段缺失所致 可设计相应的9 对扩增引物来诊断 35 基 因 诊 断 技 术 多重PCR 在一个PCR体系中加入数对PCR引物 覆盖区域不重叠 用于检测同一基因多个外显子的缺失 E1 E2

13、E3 36 五 荧光定 量 PCR 一种实时监控核酸扩增的技术 在PCR反应体系 中加入荧光基团 利用荧光信号的变化对PCR过 程进行实时监控 以此实现对初始模板的定量分 析 用途 特定DNA RNA序列的定量分析 37 原理 不同的单链DNA 即使只差1个碱基 有 不同的空间构象 即单链构象多态性 single strand conformation polymorphism SSCP 这种不同构象的单链DNA在中性聚丙烯酰胺凝胶 电泳中的迁移率不同 突变所引起的DNA构象差 异将表现为电泳带位置的差异 从而可据之作出 诊断 六 PCR SSCP 单链构象多态性 38 方法 在疑有突变的DN

14、A片段附近设计一对引物 进行PCR扩增 然后将扩增产物用甲酰胺等变性 成单链DNA 并在聚丙烯酰胺凝胶中电泳 然后 根据电泳带位置的差异进行诊断 六 PCR SSCP 单链构象多态性 用途 是检测基因未知突变的常用技术 而且适 宜于大量样本的筛选 能简便 快速 灵敏地检 测有无点突变或多态性 但如欲阐明突变的碱基 性质 则需作序列分析 39 40 ASO allel specific oligonueleotide 等位基因特异的寡核苷酸探针 当基因的突变部位和性质已完全明了时 可 以合成ASO探针 用同位素或非同位素标记 来进行诊断 探针通常为长20bp左右的核苷酸 七 PCR ASO 41

15、 用于探测点突变时一般需要合成两种探针 探针1 与正常基因序列完全一致 能与之稳 定地杂交 但不能与突变基因序列杂交 探针2 与突变基因序列一致 能与突变基因 序列稳定杂交 但不能与正常基因序列稳定 杂交 七 PCR ASO 42 PCR ASO 即先将含有突变点的基因有关片 段进行体外扩增 然后再与ASO作点杂交 优点 既简化了方法 又节约了时间 且只 要极少量的基因组DNA就可进行 七 PCR ASO 43 2Kb 突变探针杂交结果 子代 亲代 正常探针杂交结果 患儿 用ASO检测苯丙酮尿症 PKU 家系 突变纯合体杂合体正常纯合体 44 原理 在LCR体系中 需设计两对寡核苷酸探针 使第

16、一个探针的3 端与第二个探针的5 端相邻 并使两个探针分别与待测DNA完全互补 耐热 DNA连接酶就可以在第一次热变性 退火后 将 两个寡核苷酸探针连接起来 连接酶链反应 ligase chain reaction LCR 又称连接扩增反应 ligation amplification 三 连接酶链反应 LCR 45 如待测DNA在两寡核苷酸接头处有一碱基突变 置换 缺失或插入 则两寡核苷酸接头处 与待测DNA就会出现一个碱基错配 在变性和 退火后不再发生连接反应 最终也不会有突变 位点周围序列的扩增 相反 野生型基因在 LCR后会发生相应序列的扩增 通过聚丙烯酰 胺电泳就可显示其差别 三 连接酶链反应 LCR 因此 通过LCR反应 可明确区分寡核苷酸是 否与模板DNA完全互补 检测基因点突变 46 LCR产物 5 靶DNA 5 3 3 加热变性 3 5 3 5 退火 引物 引物 5 3 3 5 连接 引物 引物 再变性 退火和连接多次循环 5 3 3 5 47 优点 LCR连接反应温度接近寡核苷酸熔解温 度 Tm 识别单核苷酸错配底物的互补特异 性极高 其识别点突变的特异性高于PCR