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1、微生物技术应用课件4分离纯化 微生物技术应用从自然界分离的菌种产品基因工程诱变育种诱变育种生产用菌种扩大培养原原料微生物菌体代谢产物分离提纯发酵罐发酵条件控制接种培养基配置灭菌第一节分离纯化策略 一、建立分离纯化工艺的根据 二、分离纯化的基本过程 三、分离纯化方法的综合运用与工艺优化微生物发酵产物的分离纯化 一、建立分离纯化工艺的根据1.微生物发酵产物的特点?发酵液是复杂的多相系统，含有细胞、代谢产物和末用完的培养基等。 分散在其中的固体和胶状物质，具可压缩性，其密度又和液体相近，加上粘度很大，使从培养液中分离固体很困难。 ?培养液中所欲提取的生物物质浓度很低，但杂质含量却很高，特别是利用基因
2、工程方法产生的蛋白质常常伴有大量性质相近的杂质蛋白质。 1.微生物发酵产物的特点?另一个特点是欲提取的生物物质通常很不稳定，遇热、极端pH、有机溶剂会引起失活或分解。 ?发酵或培养都是分批操作、生物变异性大，各批发酵液不尽相同，要求下游加工有一定的弹性。 一、建立分离纯化工艺的根据2.原理 （11）物理性质力学性质重力、离心力、筛分；热力学性质状态变化、相平衡；传质性质粘度、扩散、热扩散；电磁性质电泳、电渗析、磁化； 一、建立分离纯化工艺的根据2.原理 （22）化学性质化学热力学化学平衡；反应动力学反应速率；光化学性质激光激发、离子化； （33）生物学性质分子识别生物亲和作用、生物学识别；输送
3、性质生物膜输送；反应、响应、控制酶反应、免疫系统。 一、建立分离纯化工艺的根据单元操作分离机理分离对象举例膜分离微滤超滤反渗透透析电渗析渗透气化压力差、筛分压力差、筛分压力差、筛分浓度差、筛分电荷、筛分汽液相平衡、筛分菌体、细胞蛋白质、多糖、抗生素糖、氨基酸盐、蛋白质氨基酸、有机酸乙醇萃取有机溶剂萃取双水相液膜萃取反胶团萃取超临界萃取液液相平衡液液相平衡液液相平衡液液相平衡相平衡有机酸、抗生素蛋白质、抗生素氨基酸、有机酸、抗生素氨基酸、蛋白质香料、脂质生物操作机理及其分离机理单元操作分离机理分离对象举例层析凝胶过滤层析反相层析离子交换层析亲和层析疏水相互作用层析聚焦浓度差、筛分分配平衡电荷、浓
4、度差生物亲和作用疏水作用电荷、浓度差脱盐、分子分级甾醇、维生素、肽蛋白质、氨基酸、抗生素、核酸、有机酸蛋白质、核酸蛋白质蛋白质电泳凝胶电泳等电点电泳等速电泳区带电泳筛分、电荷筛分、电荷、浓度差筛分、电荷、浓度差筛分、电荷、浓度差蛋白质、核酸蛋白质、氨基酸蛋白质、氨基酸蛋白质、核酸离心离心过滤离心沉降超离心离心力、筛分离心力离心力菌体、菌体碎片菌体、细胞蛋白质、核酸、糖类生物操作机理及其分离机理 二、分离纯化的基本过程一般说来，分离纯化的基本过程可分为44个阶段培养液(发酵液)的预处理和固液分离、初步纯化(提取)、高度纯化(精制)、成品加工。 1.一般工艺过程 二、分离纯化的基本过程22.工艺过
5、程的划分发酵的下游加工过程可以下过程 （11）预处理和固液分离目的是分离菌体和其他悬浮颗粒；除去部分可溶性杂质和改变滤液性质，以利于提取和精制的顺利进行。 （22）初步分离目的是除去与产物性质差异较大的杂质，为后来精制工序创造有利条件。 （33）高度纯化去除与产物的物理化学性质比较接近的杂质。 （44）成品制作成品形式由产品的最终用途决定。 二、分离纯化的基本过程 三、分离纯化方法的综合运用与工艺优化到目前为止，尚没有一种单一分离纯化设备和技术可以经过一步加工能够获得理想的微生物发酵产品，需要综合应用多种分离纯化设备和技术。 产品是按工序逐步分离加工出来的，对于每一操作单元或工序本身各项影响加
6、工效果的因素，如盐析或沉淀中沉淀剂的种类、浓度或离子强度及pH值等参数区间和操作条件需要进行工艺优化。 三、分离纯化方法的综合运用与工艺优化1收率与纯度之间的平衡2经济性考虑3工艺放大4纯化过程中对产品的检测应作好工序间的衔接工作，从加工产物质量、产物收率与纯度的平衡、时间与经济性等角度出发，对影响工艺流程整体纯化效果的加工条件进行优化1收率与纯度之间的平衡发酵产品有效成分分离纯化过程中，产品的纯度与产率之间是一对矛盾的关系。 比如，微生物发酵产物为药品时，其有效成分的纯度是衡量其质量优劣的重要指标，特别是非肠道药物，其纯度的高低直接关乎用药的安全性。 纯化产品产率的提高往往伴随着纯度的下降，
7、反之对产品纯度要求的提高意味着纯化成本的提高和产物收率的降低。 如何在纯化产物符合标准的前提下实现高的纯化产率，是一项纯化工艺水平的体现。 应结合对产物的质量要求、加工成本、技术上的可行性和可靠性、产物价值以及市场需求等，找出纯化工艺与加工产物纯度、生物活性和产量间的平衡点，实现工艺的最优化。 1收率与纯度之间的平衡2经济性考虑纯化工艺总体成本与纯化产物的价值必然影响纯化工艺路线的设计。 在纯化工艺流程中，产品的价值或纯化加工的成本是伴随工艺流程而递增的。 从技术设备、配制工艺处理液的原材料到纯化用介质等成本伴随产品工序流动而累加。 因此，在设计和整合全工艺流程时，应将产品处理体积大、加工成本
8、低的工序尽量前置，而价格贵的步骤应放在后续工段，以减少成本。 3工艺放大发酵产物分离纯化工艺的建立一般都经过从实验室、中试车间生产到形成工业规模生产线的放大过程，这是一项工艺诞生、发展、成熟和完善的一般规律。 其中实验室研究是大规模生产的第一步，小规模生产工艺是大规模生产工艺的基础。 尽管工艺放大过程中往往会有操作细节或条件的改变，小规模生产工艺条件优化和工序综合效果研究可为放大设计及工艺定型积累数据和提供经验。 应当注意，某些纯化工艺放大后不能重复放大前的加工性能和效果，需要调整工序单元操作程序。 如酵母细胞破碎，小量试验可采用玻璃珠震荡法或酶消化法，而大规模生产时需要高压破碎器才能达到要求
9、的破碎程度。 3工艺放大4纯化过程中对产品的检测对各工序在制品、半成品中杂质去除程度、残留物含量和目标产物成分的纯度、含量与活性等的检测是纯化工艺的重要组成部分。 在实际生产中，根据在工艺里所起作用，可将其分为在线检测、数据监测、放行检测等几类。 在线检测在工艺运行过程中，通过对在制品取样并用适当仪器和方法检测试样品相应指标、或通过安装在生产设备上的检测仪器（如感应探头等）直接检测加工物料或设备的有关数据，以了解工艺运行状况，并对其进行调整和控制。 数据监测纯化工程中往往在进一步加工前需要测试在制品的某些指标的具体数值，根据测得的数据进行计算，确定下一道工序的工艺参数后才继续加工，这种检测即为
10、数据检测。 放行检测在一道纯化工序结束后，其产物是否可以进入下一道工序继续进行分离纯化处理，应根据加工工艺的要求，对工序车间在制品设定质量标准，抽样检验在制品有关质量指标，其结果符合标准后方允许在制品进入后一道工序继续加工，这种检测就是放行检测。 第二节分离纯化技术 一、细胞破碎技术 二、沉淀分离纯化技术 三、离心分离纯化技术 四、膜分离纯化技术 五、层析分离纯化技术 六、萃取技术 七、冷冻干燥技术微生物发酵产物的分离纯化第二节分离纯化技术 一、细胞破碎技术（一）发酵液的预处理和固液分离目的分离菌体和其他悬浮颗粒(细胞碎片、核酸和蛋白质的沉淀物)；除去部分可溶性杂质和改变滤液性质，以利于提取和
11、精制的顺利进行。 方法高价无机离子的去除方法，杂蛋白质的去除，发酵液的凝聚和絮凝。 （11）钙离子，可用草酸。 草酸溶解度较小，故用量大时，可用其可溶性盐，如草酸钠。 反应生成的草酸钙还能促使蛋白质凝固，提高滤液(也称为原液)质量。 但草酸价格较贵，应注意回收。 如四环类抗生素废液中，加入硫酸铅，在60下反应生成草酸铅。 后者在9095下用硫酸分解，经过滤、冷却、结晶后可以回收草酸。 （一）发酵液的预处理和固液分离1.高价无机离子的去除方法 （22）镁离子，可用三聚磷酸钠和镁离子形成可溶性络合物，用磷酸盐处理，也能大大降低钙离子和镁离子的浓度。 此法可用于环丝氨酸的提取。 （33）铁离子，可加
12、入黄血盐，使形成普鲁士蓝沉淀。 （一）发酵液的预处理和固液分离1.高价无机离子的去除方法2.杂蛋白质的去除方法 （11）热变性 （22）沉淀 （33）大幅度改变pH（一）发酵液的预处理和固液分离3.发酵液的凝聚和絮凝凝聚和絮凝的概念，过去常常混淆，现已趋于明确区分开来。 凝聚是在中性盐作用下，由于双电层排斥电位的降低，而使胶体体系不稳定的现象。 絮凝是指在某些高分子絮凝剂存在下，基于架桥作用，使胶粒形成粗大的絮凝团的过程，是一种以物理的集合为主的过程。 （11）机理电解质将胶体粒子表面上的电荷中和，减少存在于胶体粒子间的静电斥力，使伦敦范德华吸引力占优势，这样胶体就会凝聚成较大、较密实的粒子;
13、在某些高分子絮凝剂存在下，基于架桥作用，使胶粒形成粗大的絮凝团使之更容易过滤。 （2）方法在稀溶液中加入电解质以促进凝聚和絮凝。 试剂包括酸、碱、简单电解质和合成的高分子电解质。 （3）常用的絮凝剂聚丙烯酰胺、聚乙烯亚胺、聚胺衍生物、氯化钙、磷酸氢二钠（一）发酵液的预处理和固液分离3.发酵液的凝聚和絮凝（二）微生物细胞的破碎微生物的代谢产物有的分泌到细胞或组织之外，例如细菌产生的碱性蛋白酶，霉菌产生的糖化酶等，称为胞外产物。 还有许多是存在于细胞内，例如青霉素酰化酶，碱性磷酸酯酶等，称为胞内产物。 对于胞外产物只需直接将发酵液预处理及过滤，获得澄清的滤液，作为进一步纯化的出发原液，对于胞内产物
14、，则需首先收集菌体进行细胞破碎，使代谢产物转入液相中，然后，再进行细胞碎片的分离。 一、细胞破碎技术11.微生物细胞的破碎技术常见的细胞破碎方法有机械方法（珠磨法、高压匀浆器、X X-press法、超声波破碎）和非机械方法（酶解法、渗透压冲击、冻结和融化、干燥法、化学法）（二）微生物细胞的破碎ZM系列卧式密闭珠(砂)磨机 （11）珠磨法研磨是常用的一种方法，它将细胞悬浮液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝一起快速搅拌或研磨，使达到细胞的某种程度破碎。 这些装置的主要缺点是在破碎期间样品温度迅速升高，通过用二氧化碳来冷却容器可得到部分解决。 WSK卧式高效全能珠磨机JJ-2组织捣碎匀浆机 （22）高压匀
15、浆器采用高压匀浆器是大规模破碎细胞的常用方法，利用高压迫使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击环造成细胞破裂。 （22）高压匀浆器各种菌体一次通过高压匀浆器的破碎率菌体压力（Mpa）破碎率（%）面包酵母啤酒酵母大肠杆菌解肢假丝酵母5355535562616743 （33）X-press法法一种改进的高压方法是将浓缩的菌体悬浮液冷却至-25?C C至-30?C形成冰晶体，利用500MPa以上的高压冲击，冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。 细胞破碎是由于冰晶体的磨损，包埋在冰中的微生物的变形所引起的。 该法的优点是适用的范围广，破碎率高，细胞碎片的粉碎程度低以及活性的保留率高，该法对冷冻融解敏感的生化物质不适用。 1.微生物细胞的破碎技术 （44）超声
