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1、专题5 DNA和蛋白质技术 DNA的粗提取与鉴定 课题1 一 基础知识 1 DNA粗提取的原理 1 DNA在NaCl溶液中的溶解度 是随着NaCl的浓 度的变化而改变的 当NaCl的物质的量浓度为 0 14 mol L时 DNA的溶解度最低 2 DNA不溶于酒精溶液 但是细胞中的某些物质 则可以溶于酒精溶液 DNA的溶解性和耐受性 3 蛋白酶能水解蛋白质 但是对DNA没有影响 大多数蛋白质不能忍受60 80 C的高温 而 DNA在80 C以上才会变性 洗涤剂可以瓦解 细胞膜 但对DNA没有影响 2 DNA的鉴定原理 在沸水浴的条件下 DNA遇二苯胺会被染成蓝 色 因此 二苯胺可以作为鉴定DNA
2、的试剂 注意 二苯胺要现配现用 否则会影响鉴定结果 二 实验设计 1 实验材料的选取 原则上只要含DNA的生物材料都可以 但是选 取DNA含量相对较高的生物组织 成功率更大 2 破碎细胞 获取含DNA的滤液 在鸡血细胞液中加入一定量蒸馏水并用玻棒 搅拌 过滤后收集滤液 切碎洋葱 加入一定量洗涤剂和食盐 搅拌 研磨 过滤后收集滤液 血细胞在蒸馏水中大量吸水而张裂 洗涤剂瓦解细胞膜 有利于DNA的释放 食盐溶解DNA物质 选用尼龙布进行过滤 高中生物 3 去除滤液中的杂质 方案一原理 DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同 方法 用NaCl反复溶解和析出DNA 方案二原理 蛋白酶分解蛋白质 不分
3、解DNA 方法 加嫩肉粉 含木瓜蛋白酶 方案三原理 蛋白质和DNA的变性温度不同 方法 将滤液放在60 75 的恒温水浴箱中 三个方案 高中生物 4 DNA析出与鉴定 试管2支 编号甲乙 各加5mL2mol L的 NaCl溶液 甲中放入少量白色丝状物 使之溶解 各加4mL二苯胺 混合均匀 沸水浴5min 观察颜色变化 滤液与等体积的冷却酒精 体积分数95 混合均匀 静置2 3分钟 析出的白色丝 状物就是DNA 析出 鉴定 多聚酶链式反应扩增DNA片段 课题2 高中生物 一 基础知识 高中生物 1 PCR原理 与细胞内DNA复制类似 高中生物 在PCR技术中 扩增方向 DNA的合成方向总是从子链
4、的5 端 向3 端延伸 解旋 利用了DNA的热变性原理 通过控制温 度来控制双链的解聚与结合 酶 耐高温的Taq DNA聚合酶 高温不会失活 条件 一定的缓冲溶液下才能进行 需提供DNA 模板 两种引物 四种脱氧核苷酸 耐热 的DNA聚合酶 同时要控制温度 高中生物 2 PCR的反应过程 每个循环包括 变性 复性 延伸 要经历三十多次循环 变性 模板DNA解旋 模板DNA经加热至900C以上 一定时间后 使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA 解离 使成为单链 以便于它与引物结合 为下轮反应作准备 复性 退火 模板DNA经加热变性成单链后 温度降到500C 左右 引物与模板DNA单链的
5、互补序列配对结合 延伸 DNA模板 引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用 下以脱氧核苷酸为原料 以母链为模板 按碱 基互补配对的原则与半保留复制的原理 合成 一条新的DNA链 高中生物 从第二轮循环开始 上一次循环的产物也可 以作为模板参与反应 并且由引物 延伸而成的 DNA单链会与引物 结合 进行DNA的延伸 这样 DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的 DNA序列 使这段固定长度的序列呈指数扩增 准备好PCR反应体系的配方 用微量移液器按配方在往微量 离心管中加入各组分 盖严盖子 用手指轻轻弹击管 壁混合反应液 离心10s 将离心管放入PCR仪上 设置好 循环程序进行反应 二 实验
6、步骤 高中生物 高中生物 三 结果分析与评价 1 反应液稀释 取2 LPCR反应液 添加98 L蒸馏水 2 分光光度计调零 将100 L蒸馏水添加到比色杯中 在260nm 处将分光光度计调整读数为零 3 测定 将100 L反应稀释液倒入比色杯中 测 定在260nm处的光吸收值 4 计算 DNA含量 50 光吸收值 稀释倍数 DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰 血红蛋白的提取和分离 课题3 高中生物 一 基础知识 高中生物 一 凝胶色谱法 分配色谱法 1 凝胶 一些微小多孔的球体 内含许多贯穿的通道 由多糖类构成如葡聚糖 琼脂糖 具多孔的凝 胶就叫分子筛 根据被分离物质的蛋白质相对分
7、子质量的大小 利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用 来 进行分离 2 概念 高中生物 当不同的蛋白质通过凝胶时 相对相对分子 质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道 路程较长 移动速度较慢 而相对分子质量 较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道 只 能在凝胶外部移动 路程较短 移动速度较 快 3 原理 4 具体过程 高中生物 二 缓冲溶液 高中生物 抵制外界酸 碱对溶液pH的干扰而保持pH稳定 1 原理 由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成 如 H2CO3 NaHCO3 NaH2PO4 Na2HPO4等 2 配制 调节酸和盐的用量 可配制不同pH的缓冲液 3 作用 高中生物 在血红蛋白整个实验室中用的缓冲
8、液是磷酸缓冲液 目的是利用缓冲液模 拟细胞内的PH环境 保证血红蛋白的正 常结构和功能 便于观察 红色 和材 料的科学研究 活性 1 原理 不同蛋白质的带电性质 电量 形状和大小不同 在电场中受到的作用力大小 方向 阻力不同 导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳等 在一定pH下 使蛋白质基团带上正电或负电 加入带负电荷多的SDS 形成 蛋白质 SDS复合物 使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小 三 电泳 指带电粒子在电场作用下发 生迁移的过程 高中生物 2 分离方法 3 分离过程 二 实验操作 实验步骤 样品处理 粗 分 离 纯 化 纯度鉴定 血液组成
9、成分 1 洗 涤 红 细 胞 2 释放血红蛋白 3 分离血红蛋白 4 透析血红蛋白 高中生物 血液组成成分 阅读思考 1 血液由 和 两部分组成 2 血细胞中 细胞数量最多 细胞的含量 最高的化合物是 3 该化合物是由 和 构 成的 其中每个亚基中都含有一个能与O2和CO2 结合的 基团 血浆血细胞 红细胞 血红蛋白 2条 肽链2条 肽链 亚铁血红素 血 液 血浆 水分 固体物质 血浆蛋白 无机盐 磷脂 葡萄糖等 血细胞 白细胞 血小板 红细胞 最多 血红 蛋白 两个a 肽链 两个 一肽链 高中生物 血液组成成分 1 样品处理 高中生物 1 红细胞的洗涤 除去血浆蛋白等杂蛋白 有利于后续步骤的
10、分离纯化 血液 100mL 3g柠檬酸钠 低速离心 2 min 红细胞 血 浆 吸出血浆 5倍体积生理盐水 缓慢搅拌10min 重复洗涤3次 直至上清液没有黄色 高中生物 2 血红蛋白的释放 在蒸馏水和甲苯作用下 红细胞破裂释放 目的分析 1 蒸馏水的作用是 2 加入甲苯的作用是 3 充分搅拌的目的是 使红细胞大量吸水胀裂 溶解红细胞的细胞膜 加速红细胞的破裂 3 分离血红蛋白 分离过程 红细胞 混合液 高速离心 10min 离心管 滤纸 过滤 脂类物质 烧杯 高中生物 4 透析 在透析过程中 血红蛋白溶液中的离子和 小分子不断通过半透膜扩散进入到pH 7 的磷酸缓冲液中 pH 7的磷酸缓冲液
11、维持血红蛋白的正常特性 缓冲液量远多于血红蛋白溶液量有利于杂质分 子充分地向外扩散 高中生物 2 粗分离 高中生物 3 纯化 1 凝胶色谱柱的制作 2 凝胶色谱柱的装填 教材图5 19 3 样品的加入和洗脱 透析除去分子较小的杂质 凝胶色谱操作 材料 交联葡聚糖凝胶G 75 20mmol L磷酸缓冲液 装填 2 凝胶色谱柱的装填 步骤骤操作要求 立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h洗涤平衡 一次性缓慢倒入 轻轻敲打装填悬浮液 凝胶颗粒 洗脱液 沸水浴 凝胶颗粒 蒸馏水 充分溶胀 根据色谱柱体积计算凝胶用量 色谱柱垂直固定在支架上 配制悬浮液 计算称量凝胶 固定色谱柱 高中生物 3 样品的加入和洗脱 基本过程 调节缓冲液面 加入蛋白质样品 调节缓冲液面 洗脱 收集分装蛋白质 高中生物 注意 正确的加样操作 1 不要触及破坏凝胶面 2 贴壁加样 3 使吸管管口沿管壁环绕移动 高中生物 4 纯度鉴定 通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定 高中生物 红细胞的洗涤 洗涤次数不能过少 低速 短时离心 凝胶的预处理 沸水浴法时间短 还能除去微生物和气泡 色谱柱的装填 装填尽量紧密 降低颗粒间隙 无气泡 洗脱液不能断流 色谱柱成功标志 红色区带均匀一致地移动 高中生物 作业 名师一号 谢谢合作 高中生物
