《维生素E对噪声所致耳蜗毛细胞表达NF-κB的调节》由会员分享，可在线阅读，更多相关《维生素E对噪声所致耳蜗毛细胞表达NF-κB的调节（13页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1维生素 E 对噪声所致耳蜗毛细胞表达 NF-B 的调节【摘要】 目的 探讨维生素 E 在噪声暴露引起的大白鼠听力损伤有明显的保护作用及机制。方法 以听阈、耳蜗基底膜铺片及免疫荧光染色为指标，观察大白鼠在稳态噪声持续暴露之前 30 天至暴露后7 天，灌维生素 E 或生理盐水，对大白鼠听觉脑干电位分析和耳蜗外毛细胞（OHC）丢失率分析及 NF-B 在耳蜗毛细胞中表达定量分析。结果 维生素 E 在噪声暴露后大白鼠听力阈值明显低于单纯噪声组，OHC 丢失率也明显降低，免疫荧光染色结果显示 VitE 干预组的耳蜗细胞表达 NF-B 的强度低于单纯噪声组（ P0.05） 。结论 维生素 E 在噪声暴露引
2、起的大白鼠听力损伤有明显的保护作用，通过上调耳蜗毛细胞中 NF-B 的表达。 【关键词】 噪声； 耳蜗; 毛细胞；维生素 E；NF-B【Abstract】 Objective To discuss the protection and mechanism of vitamin E in the rats hearing impairment induced by noise exposure.Methods Take the audibility threshold、basilar membrane stretched preparation and immunofluorescence st
3、ain as the index, observing that the rats were put in the stationary noise before 30days until after 2that for 7days, have vitamin E and sodium chloride , check the auditory brain stem potential and the lost rate and NF-B of the OHC in the cochlea hair cells expression quantitative analysis.Results
4、After the noise exposure, the rats which have vitamin E have significant lower auditory acuity threshold than the purely noise exposure, and much lower lost rate of OHC.Immunofluorescence stain demonstrate that the group have vitamin E have lower intensity of NF-B expression in the cochlea hair cell
5、s, （P0.05）.Conclusion Vitamin E has obvious protection in the hearing impairment of rats, working out by up-regulation of NF-B expression in the cochlea hair cells.【Key words】 noise; cochlea; hair cell; vitamin E; NF-B噪声可产生可恢复的暂时性阈移（TTS）或不可恢复的永久性阈移（PTS ） ，甚至造成噪声性耳聋。对噪声性听力损伤机制迄今尚无明确报道。本实验在大白鼠噪声暴露前 30
6、 天至暴露后 7 天灌胃维生素 E，对其防止 TTS 转变为 PTS 及促进听力恢复有无保护作用进行探讨。分析维生素 E 干预噪声听觉损伤与耳蜗毛细胞中 NF-B 表达的关系，确定 VitE 减少噪声引起的毛细胞死亡的分子机制。31 材料与方法1.1 动物分组与处理 选择鼓膜正常, 听觉脑干电位仪测 4000Hz频率双耳听阈在 2328dB 的健康雄性 Wistar 大白鼠 36 只，体质量 180200g（购自高新开发区实验动物中心，清洁级） ；随机分为 3 组；正常组 12 只（24 耳） ，维生素 E 组 12 只（24 耳） ，单纯暴露组 12 只（24 耳） 。维生素 E 组在暴露前
7、 30 天至暴露后 7 天连续灌胃4mg/（kgd ） 。单纯暴露组在暴露前 30 天至暴露后 7 天连续灌胃生理盐水5ml/（kgd ） 。 噪声暴露：连续用药 30 天后即行噪音暴露，将动物置于小笼内（40cm30cm30cm ） ，每笼2 只，放入暴露舱（0.5m1.5m0.5m） ，用 UZ-3 型噪声发生器发生， A-K200 功率放大器放大，有位于暴露舱四周的扬声器向暴露舱播放。暴露时用声压计进行连续监测，噪音保持在频率为4000Hz，平均声强为 116dB SPL（sound pressure level） 。动物暴露范围内声扬不均匀度为2dB 。持续暴露 6h。1.2 听阈测试
8、 测试在隔音屏蔽室内进行，10%水合氯醛（330mg/kg）腹腔注射，麻醉生效后安插针式电极，记录电极的安装是用不锈钢针刺入前颅顶正中穿透皮肤至颅骨骨膜，置于冠状缝中点处，同时给声耳及对侧耳后皮下分别刺入不锈钢针，作为参考电极和接地电极。TDH-39 型耳机给声，声源距耳廓 1cm，诱发电位用信号处理机叠加处理，进行测试：刺激声为交替短声4（clicks） ，重复率 10 次/s。实验选用主要参数为：带道滤波为32Hz3kHz ，扫描时间为 10ms，叠加为 512 次。测试声强由110dB SPL 开始，接近阈值后按 5dB SPL 渐档递减，电生理反射由针式电极引出，经放大及处理后以波形的
9、方式显示于荧光屏，阈值是以肉眼刚能辨认的脑干电位波群中以波的声强表示。1.3 耳蜗基底膜铺片 三组动物完成最后一次听阈测试后（噪声暴露停止后第 7 天）处死动物立即取出颞骨,打开听泡,4%甲醛固定24h,10%EDTA 脱钙 1 周, 分离出基底膜, 三组动物随机抽出各 6 只（12 耳）,在常规苏木素染色 ,在放大 400 倍的光学显微镜下，以目镜中 0.24mm 显微测微尺为测量尺度，逐个视野从蜗底向蜗顶进行OHC 记数。以 OHC 境界模糊或消失、细胞碎裂或缺失为 OHC 死亡标志。钩部和蜗尖各有 4 个视野不做记数。所得数据分析 OHC损失分布情况。1.4 免疫荧光染色 三组动物基底膜
10、各 6 只（12 耳） ，用0.1mol/L PBS 洗涤 3 次，每次 5min，加入 0.1% Triton X-100 处理 15min，5%羊血清封闭 1h，加入一抗（NF-B 工作浓度1：100 ） ，室温孵育 1h，用 0.1mol/L PBS 洗涤 3 次，每次15min，加入，Alexa Fluor555 Goat anti-rabbitIgG（工作浓度1：400 ） ，室温、避光放置 1h，0.1mol/L PBS 洗涤 3 次，每次15min，轻轻摇动。弃掉洗涤液，最后样品均再用 1g/ml 的5Hoechst 33342 室温染色 5min，甘油封片。用 Fluoview
11、 FV 1000激光扫描共聚焦显微镜观察（PMT 电压值为 650，CA 针孔值为160） 。 NF-B 阳性表达为红色荧光，细胞核为蓝色荧光。阴性对照实验中，用 PBS 代替第一抗体，排除非特异性的二抗结合。1.5 统计学分析 采用 Fluoview FV 1000 激光共聚焦显微镜分析软件分析基因表达相对荧光强度，使用 Sigma Stat.2.03（sigma ）统计软件，采用 one way ANOVA 检验，P0.05） ，差异均有显著性（P0.05）,表 1 为两组动物在噪音暴露后阈值的恢复变化,可见噪声暴露后 1h 相差不显著外补 VitE组 ABR 阈值恢复明显高于单纯暴露组。
12、见图 1。 表 1 ABR 阈值dB SPL 注：相同时间与单纯噪声组比较，*P0.0162.2 耳蜗基底膜铺片毛细胞变化 耳蜗基底膜铺片苏木素胞核染色显色结果：正常组耳蜗 HC 形态正常，其 3 排 OHC 和内毛细胞（IHC）排列整齐，结构清晰，无缺失。补 VitE 在噪声暴露第 7 天OHC 有散在缺失，且以第三排为主，单纯暴露组出现细胞境界模糊或消失，且在 3 排 OHC 中以第三排 OHC 损伤为重，缺失明显，第二排、第一排均有不同程度的缺失，IHC 也有丢失。对耳蜗基底膜铺片进行全长 OHC 记数，绘制耳蜗图，观察其 OHC 损失分布情况，补 VitE 组 OHC 缺失率明显低于单
13、纯暴露组（ P0.05） 。见图 2、图 3。2.3 耳蜗毛细胞 NF-B 的表达 单纯噪声组、VitE 干预组以及正常组在暴露后 7 天处死动物，分离耳蜗基底膜，进行 NF-B 表达定量分析。结果见表 2，图 4。VitE 干预组的耳蜗毛细胞表达 NF-B的强度低于单纯噪声组。图 1 各组 ABR 阈值的比较（dB SPL）表2 维生素 E 对噪声暴露后耳蜗毛细胞中 NF-B 表达的影响注：与单纯噪声组比较，*P0.013 讨论噪音对听觉的损伤是一个复杂的多因素的机制，各种因素又相互关联，相互影响。目前倾向于将噪声对听觉的损伤归纳为机械性、血管性和代谢性三个方面。超高强度 130dB NHL
14、 以上的噪声对 HC7的损伤主要以机械损伤为主，中高强度 110130dB NHL 噪声暴露以血管性和代谢性损伤为主。已经证实，强噪声刺激作用下耳蜗血管可发生一系列改变：血管痉挛收缩或扩张，血流速度变慢，局部血液灌注量减少；内皮细胞肿胀、通透性增加，血液浓缩粘滞度显著增高，血小板和红细胞聚集、血栓形成15 ；这些变化导致微循环障碍，耳蜗血流下降,内耳供血不足,内外淋巴液氧张力下降6，7 。血管改变引起的局部缺血缺氧，造成了耳蜗内环境的代谢紊乱，HC 代谢障碍，酶系统的功能障碍，从而细胞出现包括Corti 器形态结构的损伤和声电转换的功能障碍等一系列病理生理改变。持续的噪声一方面使耳蜗血管收缩、
15、微循环受损，局部缺血缺氧；另一方面导致耳蜗 HC 的 ATP 需要量、耗氧量以及耗葡萄糖量增加，出现局部相对缺血，自由基的增加及细胞内钙离子的超载，引起细胞结构、静纤毛、DNA 及蛋白质的异常，导致细胞坏死及凋亡；强噪声尚可引起 HC 及支持细胞酶系统的严重紊乱，造成氧和能量代谢障碍。最近研究表明8 ，噪声引起代谢性损伤首先对两个结构产生破坏，一是可影响静纤毛结构，从而造成耳蜗微机械结构的改变，二是使 IHC 过量释放神经介质，从而影响神经传导。有研究表明，噪声暴露可破坏耳蜗的抗氧化体系，导致氧化和抗氧化失衡，从而在耳蜗产生大量活性氧自由基。过量的氧自由基可以攻击生物膜，使膜发生脂质过氧化（LPO） ，诱发 LPO 的大量产生，影响细胞内的重要生化反应，对耳蜗组织产生损伤。VitE 通过自身被氧化成生育醌，从而将 ROO-转变为化学性质不活泼的 ROOH，8中断脂类过氧化的连锁反应，有效抑制脂类过氧化作用，保护细胞免受不饱和脂肪酸氧化产生的毒性物质的伤害，在防止衰老、抗肿瘤等方面起着重要的作用。VitE 本身具有产生酚氧基的结构，产生的酚氧基能够猝灭并能同单线态氧反应，保护不饱和脂肪酸免受单线态氧损伤。还可以被阴离子自由基和羟自由
