《维拉帕米诱导人视网膜色素上皮细胞凋亡及细胞内钙变化》由会员分享，可在线阅读，更多相关《维拉帕米诱导人视网膜色素上皮细胞凋亡及细胞内钙变化（10页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1维拉帕米诱导人视网膜色素上皮细胞凋亡及细胞内钙变化【摘要 】 目的：探讨钙通道拮抗剂 维拉帕米（verapamil，Ver）对体外培养的人视网膜色素上皮（ human retinal pigment epithelium,hRPE）细胞凋亡诱导作用及凋亡过程中细胞内钙浓度Ca2+i 的变化。方法：应用 80mg/L 的 Ver 作用体外培养 hRPE 细胞 12，24 及 48h，采用吖叮橙（ AO）荧光染色法、透射电镜、流式细胞术观察 hRPE 细胞凋亡；Fluo-3/AM 负载技术，观察凋亡过程中细胞Ca2+i 的变化。结果：一定浓度 Ver可诱导 hRPE 细胞凋亡，荧光显微镜及电镜观
2、察 hRPE 细胞具有早期凋亡特征：核荧光呈黄绿色，电镜下核染色质浓染、边集。流式细胞术显示，Ver 作用后的 hRPE 细胞凋亡百分率增加（F 12.3415 ，P 0.05） 。Ver 作用的 hRPE 细胞内钙浓度（Ca2+i）呈下降趋势（F 23.607 ， P 0.01） 。 结论：Ver 能诱导体外培养的 hRPE 细胞凋亡，细胞内Ca2+i 浓度的变化可能是诱导hRPE 凋亡的机制之一。 【关键词】 视网膜色素上皮细胞20 引言增殖性玻璃体视网膜病变（proliferative vitreo retinopathy，PVR ）是孔源性视网膜脱离的常见并发症和手术失败的主要原因，尽
3、管玻璃体视网膜手术技术不断提高，但复发率并未改善1 ，同时玻璃体切割手术本身就是诱导 PVR 形成的一个危险因素2。RPE 细胞的迁移、增殖可启动 PVR 的形成，而细胞内Ca2+的升高是 RPE 细胞增殖的危险因素3。Ver 是一种可靠的慢钙通道阻滞剂，能阻止细胞外钙内流，在 PVR 发生中对 RPE 细胞增殖起着重要调节作用4。本研究应用一定浓度钙通道阻断剂Ver，作用于体外培养 hRPE 细胞，诱导其凋亡并观察凋亡过程中细胞内Ca2+i 的变化。1 材料和方法1.1 材料 流式细胞仪（B.D 公司） ，DIAGNOSTIC INSTRUMENTS-SPOT INSIGH 荧光摄像（USA
4、）系统及MetaFluo4.5/coolsnapfx/IX70 细胞内钙离子荧光成像（ USA）测定系统。DMEM 培养基(Gibco) 、新生牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)、胰蛋白酶(1250 Difco，Gibco)、维拉帕米（verapamil，Ver） 、二甲基亚砜（DMSO） 、吖叮橙（AO） 、A23187 均为美国 Sigma 公司产品；Fluo-3/AM 荧光探针3（Eugene Oregon, USA） ；其它试剂均为国产分析纯。采用胰蛋白酶消化法5。在无菌状态下，取角膜移植后的供体眼球（供体年龄限制 2438 岁） ，在无菌 PBS 液中沿角巩膜缘后 2mm 处环形
5、剪开，弃去眼前节及玻璃体，自视盘处分离视网膜神经上皮层，加入2.5g/L 胰酶消化混合液，于 37消化 1h，加入含 200mL/L 新生牛血清 DMEM 的培养液，用吸管吹打 RPE 细胞面使细胞脱落，将含 RPE 细胞的液体移入离心管中，离心 1 000r/min8min，弃上清后，加入培养液，调整细胞密度 1105/L，将 RPE 细胞悬液接种于 6 孔板内，37，50mL/L CO2 孵箱中培养。RPE 传代培养同文献6，36 代细胞用于本实验。1.2 方法 将第 3 代的 hRPE 细胞种植于内置盖玻片的 24 孔板中，加入 Ver 80mg/L，作用 12，24，48h 后，取出玻
6、片，与未加药的对照组，投入 950mL/L 乙醇中固定 30min，微干，10mL/L 醋酸作用 30s，110-4 吖啶橙（AO ）染色 1min，0.1mol/L 氯化钙处理 2min。PBS 漂洗 3 次。且用 PBS 封片，荧光显微镜下直接观察，每孔重复 3 次。在 4条件下离心，收集 80mg/L Ver 作用12，24，48h 后及未加药的 hRPE 细胞 5106 个/L，加入等量25g/L 戊二醛固定，离心 5min，弃去上清，移至离心管中，加入25g/L 戊二醛固定，4作用 30min。常规电镜固定包埋，柠檬酸铅染色，透射电镜上观察，摄片。以 80mg/L 浓度的 Ver，作
7、用12，24，48h 后，收集 2106/L 个细胞，离心 1 4000r/min5min，PBS 漂洗 1 次。离心去 PBS，加入 PI 染液0.5mL，4 避光作用 30min。荧光染色剂 PI 用氩离子激发荧光，激光发光波长 488nm，流式细胞仪采集数据，cellquest 分析软件分析，通过计算凋亡区（亚二倍体区）细胞数量得出凋亡率。每个样本重复 3 次。将 1105/L 细胞接种于 3.5cm2 的一次性培养皿中，待细胞 80%融合后，加入终浓度 80mg/L 的 Ver，作用12，24，48h ，换液后，加入无血清 DMEM 液体 1mL，加入终浓度 10mol/L FLUO-
8、3/AM 染色，37 ，50mL/L CO2 孵箱内孵育45min，PBS 充分洗去染料，室温静置 15min 后，置于MetaFluo4.5/coolsnapfx/IX70 细胞内钙离子荧光成像测定系统操作台上，25测定单个细胞钙荧光强度，激发波长 488nm，40 倍物镜观察，每组计算 20 个单个细胞钙离子浓度，取其均值。加入A23187 5mol 测定最高荧光强度值， 加入 0.2mmolMnCl2 测定最低荧光强度值，细胞内钙浓度按Ca2+iKd（Fmax-F）/（F-Fmin）公式计算， Kd400，Fmax 为最强荧光值， Fmin 为最低荧光值，F 为测得细胞荧光值。统计学处理
9、：采用方差分析进行统计学检验，统计过程均用SPSS10.0 软件进行，数据用 xs 表示。2 结果52.1 AO 染色结果 在荧光显微镜下，未加药组 AO 染色的 HRPE细胞呈梭形，细胞质呈红色荧光，细胞核呈绿色均匀荧光，可见深染细胞核核仁（图 1） 。 经 80mg/L Ver 作用后，可见凋亡细胞呈圆形，体积明显缩小，细胞核内可见致密浓染的黄色荧光（图 2） 。Ver 作用 48h 后的凋亡细胞数量比 24h 的明显增多，贴壁细胞明显减少。而作用 12h 的细胞与未加药组细胞比较无明显变化。图 1 正常 hRPE 细胞呈梭形，细胞质呈红色荧光，细胞核呈绿色均匀荧光，可见深染细胞核核仁 A
10、O200图 2 Ver 作用 hRPE 细胞 48h，细胞呈圆形，体积明显缩小，细胞核内可见致密浓染的黄色荧光 AO2002.2 透射电镜结果 正常 hRPE 细胞超微结构见细胞核膜完整，染色质均匀分布。Ver 作用 12h 后，细胞超微结构与未加药组无明显差异。作用 24h 时凋亡的细胞在电镜下可见：细胞核内出现染色质边集及染色体固缩，电子密度增强，细胞体积变小，细胞浆浓缩，其内细胞器保存较好，细胞浆内可见空泡增多，细胞膜保存完整，可见细胞膜芽生出泡现象。48h 时可见核染色质浓缩和细胞膜芽生出泡（图 3） 。图 3 Ver 作用 48h 的 HRPE 细胞，电子密度增强，核膜凹陷，6染色质
11、浓缩，边集 TEM6 7002.3 流式细胞仪检测结果 Ver 作用 12h 时，G0/G1 期前可亚二倍体峰，24，48h 亚二倍体峰逐渐增高。根据流式细胞仪显示G0/G1 期前的亚二倍体区所占百分率计算凋亡率，Ver 作用12，24，48h 的凋亡率（%）分别为8.211.20，16.144.60，23.933.63 ，组间比较，差异有显著性意义（F12.3415， P0.05）, 随着时间的延长，凋亡率逐渐增加。2.4 hRPE 细胞Ca2+i 变化 荧光图像显示，正常 HRPE 细胞显示 Ca2+荧光分布，胞核荧光最强，胞质次之（图 4，5） 。Ver 可降低 hRPE 细胞内Ca2+
12、i,正常 hRPE 细胞及 Ver 作用 hRPE 细胞12，24，48h 时细胞内Ca2+i（nmol/L ）分别为197.2529.03、176.0925.88，156.4520.60，135.2821.18，组间比较，具有显著性差异（F23.607，P0.01)。图 4 正常 HRPE 细胞钙荧光，见细胞内钙荧光，胞核荧光强，胞核次之 Fluo-3/AM400图 5A-C 分别为 Ver 作用 12，24，48h 时 hRPE 细胞钙荧光像，可见钙荧光强度逐渐减弱 Fluo-3/AM40073 讨论研究认为，PVR 是眼组织对创伤修复反应的一种过度增殖的结果，其基本病理过程是原发性视网膜
13、脱离或眼球穿通伤后的炎症反应，宿主细胞的游走、增生、膜形成，增生膜与视网膜粘连和收缩，形成对视网膜的牵拉，引起牵拉性视网膜脱离。细胞迁移、增殖、收缩是形成 PVR 的关键病理过程，抑制这些病理过程的发展可防止PVR 的形成。 Ca2+作为细胞的第二信使及细胞增殖的启动因子，其浓度的变化对细胞生长及有丝分裂具有调控作用，同时第二信使Ca2+的变化是 PVR 发病机制之一7 。国外研究发现降低细胞内Ca2+浓度可抑制 RPE 细胞增殖8，我们的前期工作已证明 hRPE细胞冷冻后细胞内 Ca2+浓度明显增高，因此推测细胞内游离 Ca2+浓度的增高可能是 hRPE 细胞迁移和增殖的机制之一9,10。我
14、们应用 80mg/L Ver 作用体外培养的 hRPE 细胞， AO 荧光染色、透射电镜和流式细胞术检测，可见典型的凋亡改变，而且随着作用时间延长，细胞凋亡百分比逐渐增高，表明一定浓度 Ver 可诱导 hRPE细胞凋亡。同时为研究 hRPE 细胞凋亡与细胞内Ca2+i 关系，应用 Fluo-3/AM 荧光探针测定凋亡过程中 hRPE 细胞内 Ca2+i 的变化。Fluo-3/AM 是新一代钙离子荧光染料，它在可见光谱激发，激发波长 488nm，因而减少了需紫外光作激发时对活细胞的光损伤，其与8Ca2+结合式的荧光强度较游离形式高 40100 倍。因而避免了自发荧光的干扰。Fluo-3 与 Ca
15、2+亲和力低，容易解离，适合测定细胞内 Ca2+的快速、微量变化。 Rosenthal 等11在培养不同物种的RPE 细胞时发现，RPE 细胞膜上存在电压依赖 Ca2+通道，而且这种离子通道为典型的 L 型通道，Himpens 等12在培养 hRPE 细胞时探讨 Ca2+信号转导机制，认为 RPE 细胞内及细胞膜之间均有Ca2+流的改变，hRPE 细胞这种典型的 L 型通道对 Ver 敏感。结合本研究结果，Ver 阻断了 hRPE 细胞的 L 型通道，降低细胞内Ca2+i，引起细胞内钙平衡破坏，进而诱导 hRPE 细胞凋亡。Ca2+i 的变化可能是 hRPE 凋亡的关键信号，同时凋亡的产生也可
16、能涉及其他信号系统，尚待进一步实验来证明。Ver 是一种可靠的慢钙通道阻滞剂，降低细胞内Ca2+i ，而且抑制体外培养 hRPE 细胞增殖13。本研究选用 Ver 作用体外培养的 hRPE 细胞，发现 Ver 能诱导 hRPE 细胞凋亡，同时发现细胞内Ca2+i 的变化可能是 hRPE 细胞凋亡的关键信号。如能将此药物应用扩展到诱导凋亡，且作用于眼内 RPE 细胞，具有较好的发展前途。【参考文献】1 Minihan M, Tanner V, Williamson TH. Primary rhegmatogenous retinal detachment: 20 years of change. Br J 9Ophthalmol ,2001;85(5):546-5482 Campochiaro PA. Patho
