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1、1结核杆菌 H37Ra 免疫小鼠后脾淋巴细胞的杀伤活性及免疫机制的研究作者：王利娴, 卢贤瑜, 李惠, 阳强【关键词】 结核杆菌 H37Ra;,Ag85B 蛋白;,小鼠淋巴细胞;,穿孔素;,颗粒酶 BStudy on the cytotoxicity of spleen lymphocytes and immune mechanisms in mice immunized by Mycobacterium tuberculosis H37RaAbstract AIM: To explore the specific cytotoxicity of spleen lymphocytes and
2、the immune mechanisms in mice immunized by Mycobacterium tuberculosis（MTB）H37Ra. METHODS: At the various interval (30days, 60days) after the mice were immunized by MTB H37Ra, BCG and PBS, the spleen lymphocytes of the immunized mice were used as the effector cells while the Sp2/0 cells expressing th
3、e secreted protein Ag85B were used as the target cells, and the cytotoxicity of spleen lymphocytes in the immunized mice was measured by MTT assay. Spleen lymphocytes were J2collected at 60 days after immunization and stimulated with PPD, and the expression of perforin, granzyme B on mRNA level was
4、detected by RTPCR. RESULTS: The cytotoxicity of spleen lymphocytes in the group immunized by MTB H37Ra was significantly higher than that of PBS control group(P005), and slightly higher than that of BCG group. The mRNA expression of perforin, granzyme B in H37Ra group and BCG group was significantly
5、 higher than that in PBS control group (P005); the expression of perforin mRNA in H37Ra group was significantly higher than that in BCG group (P005), but there was no obvious difference with regard to the expression of granzyme B mRNA between H37Ra group and BCG group. CONCLUSION: The cytotoxicity o
6、f spleen lymphocytes is enhanced after mice were immunized by MTB H37Ra, which may be related to the expression of perforin and granzyme B.KeywordsMTB H37Ra; Ag85B protein; spleen lymphocyte; perforin; granzyme B摘 要 目的: 探讨结核杆菌 H37Ra 免疫小鼠后, 产生特异性的脾淋巴细胞杀伤活性及其免疫机制。方法: (1)分别以结核杆菌J3H37Ra、 BCG 和 PBS 免疫小鼠后
7、第 30 天及第 60 天, 分离各组小鼠脾淋巴细胞作为效应细胞, 以表达 Ag85B 分泌蛋白的 Sp2/0 细胞为靶细胞, 用 MTT 比色法检测免疫小鼠脾淋巴细胞的杀伤率; (2)在免疫后第 60 天, 小鼠脾淋巴细胞经 PPD 刺激后, 以 RTPCR 法检测穿孔素 mRNA 及颗粒酶 B mRNA 的表达。结果 : (1)结核杆菌H37Ra 组脾淋巴细胞的杀伤率明显高于 PBS 对照组(P0.05), 略高于 BCG 组 ; (2)H37Ra 组和 BCG 组穿孔素、 颗粒酶 mRNA 的表达量均显著高于 PBS 组（P0.05 ）, H37Ra 组穿孔素 mRNA 的表达量显著高于
8、 BCG 组(P0.05), 但颗粒酶 B mRNA 的表达量两组无差异。结论: 结核杆菌 H37Ra 免疫小鼠后, 能增强脾淋巴细胞的杀伤活性, 其机制可能与增加穿孔素、 颗粒酶 B 的表达有关。关键词结核杆菌 H37Ra; Ag85B 蛋白; 小鼠淋巴细胞; 穿孔素; 颗粒酶 B近年来, 由于人口流动的增加, 多重耐药菌株的流行, 以及结核分枝杆菌（MTB）和 HIV 的双重感染, 导致 TB 的发病率和死亡率大副度提高。而目前惟一获准使用的卡介苗（BCG）的预防效果又不甚理想, 对不同的人群保护力差异较大 , 因此, 世界各国加强了对宿主抵抗结核杆菌免疫机制的研究。H37Ra 是由 H3
9、7Rv（人型结核分枝杆菌标准毒株）多次传代后获得的无毒株。国内外文献报道, H37Ra 具有毒力较低、 抗原性完整1, 2及能充分活化巨噬细J4胞3, 4等优点, 因此, 结核杆菌 H37Ra 作为侯选减毒活疫苗具有相对的优势。然而如何提高 CD8+ T 细胞的特异性杀伤活性, 是研制新型抗结核疫苗迫切需要考虑的问题。以往结核疫苗的研究中, 有关特异性小鼠脾淋巴细胞杀伤作用的研究较比浮浅。Ag85B 是结核分枝杆菌的主要分泌蛋白, 可诱发对 MTB 的保护性免疫应答。本研究中拟用能表达此目的蛋白的 Sp2/0 细胞为靶细胞, 检测结核杆菌H37Ra 免疫小鼠后, 诱导机体产生特异性脾淋巴细胞杀
10、伤活性的效果, 并从分子水平上检测穿孔素、 颗粒酶 mRNA 的表达, 以探讨小鼠脾淋巴细胞抗 MTB 感染的免疫机制。1 材料和方法1.1 材料 携带有 Ag85B 分泌蛋白基因的真核表达质粒pTB30m, 由华中科技大学同济医学院微生物教研室范雄林博士馈赠, 本室保存。结核杆菌 H37Ra、 BCG 菌株由本室保存。Sp2/0细胞由重庆医科大学感染病研究所提供。Lipofectamine 2000 购自美国 Invitrogen 公司。总 RNA 提取试剂 Trizol 购自上海生工公司。RTPCR 试剂盒购自 TaKaRa 公司。PPD 标准品购自成都市生物制品研究所。抗 Ag85B 分
11、泌蛋白的多克隆抗体本室制备。HRP 标记的羊抗鼠 IgG 及二氨基联苯胺(DAB) 购自北京中杉公司。 G418、 RPMI1640 培养液、 MTT 和淋巴细胞分离液, 均购自北方同正公司。小牛血清购自 GIBCO 公司。SPF 雌性 C57BL/6 小鼠, 68 周J5龄, 质量 1820 g, 购自重庆医科大学实验动物中心。1.2 方法1.2.1 实验分组 将 66 只 C57BL/6 小鼠随机分成 3 组, 即H37Ra 免疫组（24 只） 、 BCG 免疫组（24 只）和 PBS 对照组（18 只） 。H37Ra 和 BCG 免疫组于每只小鼠尾部皮内, 分别注射H37Ra 和 BCG
12、 菌液各 01 mL(含活菌数约 2106 个), PBS 对照组每只小鼠注射 PBS 溶液 0.1 mL。1.2.2 Sp2/0 细胞中 Ag85B mRNA 及其蛋白表达的检测 以重组质粒 pTB30m 转染 Sp2/0 细胞后, 用琼脂糖凝胶电泳检测Sp2/0 细胞中 Ag85B mRNA 的表达5, 并用免疫细胞化学染色法检测 Ag85B 蛋白的表达。1.2.3 小鼠脾淋巴细胞杀伤活性的检测 以携带 Ag85B 蛋白基因的真核表达质粒 pTB30m 转染的 Sp2/0 细胞（16108/L）为靶细胞, 以免疫后第 30 天及第 60 天各组小鼠的脾淋巴细胞（4109/L）为效应细胞,
13、按效靶比为 251、 501和 1001, 用 MTT 比色法进行杀伤实验。具体步骤如下: 于 96 孔板的实验孔及效应细胞对照孔中, 每孔加入 10 L PPD（终浓度为 10 mg/L）, 同时以培养液作为对照孔, 每孔溶液的体积均为 150 L。实验设 3J6个复孔, 于 37、 50 mL/L CO2 培养箱中培养 72 h 后, 按上述不同比例的效靶比, 于培养板的实验孔中 , 每孔加 100 L靶细胞, 同时以靶细胞作为对照孔, 每孔溶液的体积均为 250 L。于 37、 50 mL/L CO2 培养箱中培养 24 h 后, 每孔加入 5 g/L MTT 10 L, 以 1500
14、r/min 离心 10 min。吸弃上清, 每孔加入 DMSO 150 L, 振荡 10 min, 于波长 570 nm 用酶标仪测定吸光度（A）值, 并按下列公式计算小鼠脾淋巴细胞的杀伤率（%） 。杀伤率=1 （效靶细胞的 A 值效应细胞的 A 值）/靶细胞的 A 值100%。1.2.4 脾淋巴细胞中穿孔素、 颗粒酶 B mRNA 表达的检测1.2.4.1 总 RNA 的提取及 cDNA 的合成 于免疫后第 60 天, 分离各组小鼠（各 6 只）的脾淋巴细胞 , 用含 100 mL/L 小牛血清的 RPMI1640 培养液调整细胞的密度为 4109/L。在 24 孔细胞培养板中, 每孔加上述
15、细胞悬液 1 mL, 并加入终浓度为 10 g/L 的刺激物 PPD, 于 37、 50 mL/L CO2 培养箱中培养 24 h, 收集各孔的细胞。用 PBS 缓冲液洗 2 次, 采用 Trizol 法提取总 RNA, 并测定RNA 的含量, 检测 RNA 的完整性。按 TaKaRa 公司 RTPCR 试剂盒的反转录反应方法, 合成 cDNA 链。1.2.4.2 穿孔素、 颗粒酶 B 的 PCR 扩增 （1 ）引物的设计与合成: 扩增穿孔素基因6上游引物的序列为: GAG CCC CTG CAC J7ACA TTA CTG GAA, 下游引物的序列为 ACA TTC TCA AAG TCC
16、ATC T。扩增颗粒酶 B 基因上游引物的序列为 : CTG CTA CTG CTG ACC TTG TCT CT, 下游引物的序列为 ATG TCT AGT CCT CTT GGC CTT AC。扩增鼠源性内参照 action基因上游引物的序列为: GGG AAT GGG TCA GAA GGA CTC, 下游引物的序列为 AGA AGG AAG GCT GGA AAA GAG C。 （2） PCR 反应体系为: 已合成的 cDNA 模板 25 L、 5PCR Buffer 25 L、 灭菌蒸馏水 72 L、 EX Taq HS 006 L、 上、 下游特异性引物各 02 L（引物浓度均为 20 pmol/L）, 混匀后加入到 0.2 mL
