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1、1结核分枝杆菌重组蛋白的制备及抗原性分析作者：苏明权，岳乔红，周萍，段艳，杨柳，杨军兰，刘家云，郝晓柯【关键词】 结核分枝杆菌；抗原；基因表达；ELISAPreparation and antigenicity assay of recombinant proteins of Mycobacterium tuberculosis【Abstract】 AIM: To clone and express the Mr 16103 and Mr 38103 proteins of Mycobacterium tuberculosis in E. coli， and to characterize i
2、ts antigenicity and specificity. METHODS: The Mr 16103 and Mr 38103 antigen genes were amplified from Mycobacterium tuberculosis genome DNA by polymerase chain reactions and cloned into pGEX4T2 expression vector after sequencing. BL21 strain of E.coli was transformed with the recombinant vectors and
3、 induced to express recombinant proteins. The proteins were purified by affinity column chromatography. The antigenicity and specificity of purified proteins were estimated by enzymelinked immunoabsorbant assay. RESULTS: The BL21 2strains of E. coli with recombinant vectors showed 42 and 18% of Mr 1
4、6103 （688 mg/L） and Mr 38103 （217 mg/L） gene expressions after induction. The sensitivity of Mr 16103 and Mr 38103 proteins were 67.0 and 79.8, specificity were 100 and 99，accuracy were 84.0 and 89.7 respectively. CONCLUSION: The expressions and purifications of recombinant Mr 16103 and Mr 38103 ant
5、igens with good antigenicity and specificity facilitate their research and clinical application in the diagnosis of Mycobacterium tuberculosis.【Keywords】 Mycobacterium tuberculosis； antigen； gene expression； enzymelinked immunoabsorbant assay【摘要】 目的：克隆表达结核分枝杆菌 Mr 16103 和 Mr 38103 重组蛋白，测定其抗原性和特异性. 方法
6、： 利用聚合酶链反应自结核分枝杆菌基因组 DNA 扩增 Mr 16103 和 Mr 38103抗原基因，经测序鉴定后克隆于 pGEX4T2 表达载体，转化于大肠杆菌 BL21 菌株进行诱导表达，利用 GSTrapFF 蛋白柱纯化表达产物，通过酶联免疫吸附测定(ELISA) 检测其抗原性与特异性. 结果：携带重组质粒的菌株经诱导产生的表达量分别为 42和 18；Mr 316103 和 Mr 38103 蛋白量分别为：688 mg/L 和 217 mg/L. 其中 Mr 16103 蛋白作为包被抗原 ELISA 法检测的灵敏度为67.0, 特异性为 100, 准确性为 84.0；Mr 38103
7、蛋白作为包被抗原 ELISA 检测的灵敏度为 79.8%,特异性为 99%，准确性为89.7%. 结论：以 Mr 16103，Mr 38103 重组蛋白为抗原具有良好的抗原性和特异性，可用于结核分枝杆菌诊断方法的建立及临床诊断.【关键词】 结核分枝杆菌；抗原；基因表达；ELISA【中图号】 R3780 引言结核病仍是目前危害全球人类健康的重要传染病，我国每年约有 13 万人因结核病而死亡. 对结核病的实验诊断主要依据细菌学检查和血清学检测，细菌学检查繁琐费时，培养周期长，达不到快速诊断的目的，血清学检测是一种方便快捷的实验室诊断方法，血清学检查的关键是结核分枝杆菌特异性抗原的提呈. 我们利用基
8、因工程重组方法，通过大肠杆菌表达结核分枝杆菌的 Mr 16103 和Mr 38103 蛋白，以 Mr 16103 和 Mr 38103 重组蛋白为抗原，通过酶联免疫吸附试验测定两种抗原的反应性和特异性，以期证实4其在血清学诊断中的价值.1 材料和方法1.1 材料结核分枝杆菌 H37RV 标准株（菌株号：ATCC27294）：购自卫生部国家菌种保存中心. E.coli DH5，E.coli BL21 由第四军医大学西京医院检验科保存；T4 连接酶、限制性核酸内切酶 BamH, EcoRDNA 胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒均购自 Vitagene 公司；GST 亲和层析柱 GSTrapFF 购自
9、Pharmacia 公司；pGEX4T2 表达载体购自 Pharmacia 公司.1.2 方法1.2.1 结核分枝杆菌 Mr 16103， Mr 38103 抗原基因的PCR 扩增结核分枝杆菌 H37Rv 培养物经煮沸灭活，蛋白酶 K 消化过夜，经酚. 氯仿抽提、乙醇沉淀纯化 DNA. 通过 PCR 扩增 Mr 16103，Mr 38103 基因. Mr 16103 抗原基因引物为： 5AGGGGATCCATGGCCACCACCCTTCCCGTTCAG3含 BamH I酶切位点和起始密码子，5TCAGCTCGAGCCCAGTGGTCAGTTGGTGGACCG3含 Xoh I 酶切位点和终止密码
10、子，预期扩增产物 435 bp. Mr 38103 基因引物为：5AGGGGATCCGTGAAAATTCGTTTGCATACGCT3含5BamH I 酶切位点和起始密码子，5GATGAATTCACGGAGGTTGCTGTCGCGTGGTG3含 Xoh I 酶切位点和终止密码子，预期扩增产物 1122 bp. PCR 反应程序为：94预变性 5 min，94 30 s，60 30 s，72 1 min，共 30个循环，最后 72延伸 10 min. 琼脂糖凝胶电泳鉴定 PCR 结果.1.2.2 基因的克隆与鉴定用胶回收试剂盒回收目的片段，将Mr 16103，Mr 38103 抗原基因与质粒 pG
11、EX4T2 同时用BamH I 与 Xoh I 双酶切，T4 连接酶连接，重组质粒转化 E.coli DH5 感受态细胞. 利用 Vitagene 公司提供的小量质粒提取试剂提取质粒 DNA，序列测定由上海生工生物工程公司完成.1.2.3 表达载体的构建将携带 Mr 16103，Mr 38103 抗原基因的重组质粒进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳分离，切胶回收基因片段，Vitagene 公司凝胶抽提试剂盒纯化，连接于双酶切的pGEX4T2 表达载体，T4 DNA 连接酶连接，转化于 E.coli DH5 感受态细胞. 挑选单菌落，抽提质粒，酶切检测，并进行序列测定以证实插入序列是否正确. 挑选测序正
12、确的重组表达载体质粒，再转化于 BL21 菌株.1.2.4 重组质粒的诱导表达及纯化将携带重组表达载体的BL21 菌株接种于含氨苄青霉素 0.1 g/L 的 LB 培养基，37 振荡培6养过夜. 然后从中取 1 mL 接种于 100 mL 新鲜含氨苄青霉素的 LB液体培养基， 37振荡培养 3 h，加人诱导剂 IPTG 至终浓度 0.1 mmolL，37 继续培养 5 h. 离心收集菌体. 将诱导前后的样本各加入 2样品缓冲液 100 L，95沸水浴 10 min，10 000 g 离心 10 min，取 10 L 上清进行 120 g/L SDSPAGE. 凝胶用考马斯亮蓝染色 2 h，脱色
13、 35 h，观察目的蛋白，用 CS9000 薄层扫描仪在 580 nm 波长下对 SDSPAGE 蛋白电泳凝胶上的蛋白条带进行扫描，确定菌体总蛋白中目的蛋白比例. 用 GSTrap FF 蛋白纯化柱和凝血酶进行目的蛋白的纯化，按试剂盒说明书进行，得到纯化的重组结核杆菌 Mr 16103，Mr 38103 蛋白用 SDSPAGE 蛋白电泳进行检测.1.2.5Mr 16103，Mr 38103 重组蛋白抗原的 ELISA 检测对西安地区收集的 94 份血清样品进行 ELISA 检测，其中肺结核患者血清 90 份（经集菌涂片染色法或培养实验证实为结核分枝杆菌阳性） ，正常健康人血清 100 份为阴性
14、对照. 将纯化 Mr 16103，Mr 38103 抗原溶液稀释于 PBS 溶液，37 包被酶标板 2 h. PBST 溶液（ PBS 内含 0.5 g/L Tween20）洗涤，再用封闭液（PBST 内含 1 gL 牛血清清蛋白)37封闭 1 h，然后用 PBST溶液洗涤. 加入 1 L 血清样品，37温育 1 h，PBST 溶液洗涤. 加入 11000 稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗人 IgG，37温育30 min. 加入四甲基联苯胺显色液，室温显色 30 min 后终止反应. 7450 nm 检测吸光度值.2 结果2.1 目的基因的扩增与克隆用蛋白酶裂解法提取的结核杆菌基因组 DNA 用
15、特异的引物进行 PCR 扩增，经琼脂糖凝胶电泳，证实所得到的 PCR 产物为目的基因片断，与在 GenBank 中查到的结核分枝杆菌 Mr 16103，Mr 38103 蛋白的基因大小基本一致（图 1）. 提取质粒，分别经双酶切后，得到 435 bp 和 1122 bp的目的基因片段以及载体 pGEX4T2 的 4950 bp 片断，而空质粒对照只得到一条 4970 bp 左右的片段（图 2）. 经测序证实目的基因的序列完全正确，未发生突变.图 1PCR 扩增产物琼脂糖凝胶电泳（略）1,2: 空质粒 pGEX4T2 的 BamH和 Xho双酶切结果; 3: DNA 分子量标准 ; 4,5: 重
16、组质粒 pGEX16 的 BamH和 Xho 双酶切结果; 6,7: 重组质粒 pGEX38 的 BamH和 Xho双酶切结果.图 2 重组质粒 pGEX16 和 pGEX38 的酶切鉴定（略）2.2 表达载体构建与重组蛋白诱导表达进一步测序表明， pGEX16 及 pGEX38 中的插入序列及读码框架正确. 将测序正确的8pGEX16， pGEX38 和 pGEX4T2 分别转化感受态 E.coli DH5，在 37用 1.0 mmol/L IPTG 诱导后，分别取菌株进行 120 g/L SDSPAGE. 结果表明，pGEX16 转化的菌株在 Mr 42103 处出现一条新生蛋白条带，pGEX38 在 Mr 64103 处出现一条新生蛋白条带，均与预期结果一致；而 pGEX4T2 转化的菌株则只在 M
