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1、1结核分枝杆菌 MPT64作者：师长宏，安家泽，唐小凤，王晓武，张海，柏银兰，徐志凯【关键词】 结核分枝杆菌Immune responses and protective efficacy induced in mice by Mycobacterium tuberculosis MPT64ESAT6 fusion protein【Abstract】 AIM: To evaluate humoral and cellmediated immune responses by MPT64 and ESAT6fusion proteins and to test protective efficac
2、y against Mycobacterium tuberculosis (MTB) challenge. METHODS: BALB/c mice were immunized 3 times at 2week interval subcutaneously on the back with fusion protein MPT64ESAT6. In the spleen lymphocytes of immunized mice stimulation index (SI) was measured by MTT method and the level of secreted IFN w
3、as detected by ELISA. Some of vaccinated BALB/c mice by fusion proteins were intravenously infected with 1105 CFU MTB strain H37Rv. Four weeks later，bacterial load in spleens was determined. RESULTS: The titer of sera specific antibody in BALB/c mice immunized with 2fusion expression protein MPT64ES
4、AT6 was 11500. The SI of lymphocytes in fusion protein immunized group was 2.23, significantly higher than that of saline immunized group (0.88). The IFN level in culture supernatant of spleen lymphocytes from the mice immunized with fusion proteins were (4.280.27) g/L, significantly higher than tha
5、t of saline immunized group (0.480.17) g/L, P0.05, but lower than that of Bacillus Calmette Guerin (BCG) immunized group (5.180.31) g/L. Compared with saline immunized mice（bacterial load was 6.450.17）, dramatic reductions were observed for MTB replication in the spleen from BALB/c mice immunized wi
6、th fusion proteins (bacteria load was 5.040.11) following a subsequent challenge, but the protective efficacy in mice immunized with MPT64ESAT6 was not as good as that of BCG immunized group (bacterial load was 4.380.22). CONCLUSION: MPT64 and ESAT6 fusion proteins could be used as a novel component
7、 of the new TB vaccine.【Keywords】 Mycobacterium tuberculosis；vaccine；MPT64；ESAT6；fusion expression3【摘要】 目的：测定 MPT64 与 ESAT6 融合蛋白在小鼠体内诱导的免疫应答及保护力. 方法：将 MPT64 与 ESAT6 的融合蛋白皮下免疫小鼠 3 次，每次间隔 2 wk，ELISA 测定免疫小鼠血清特异性抗体的滴度. 最后一次免疫完成后 4 wk，分离部分免疫小鼠脾淋巴细胞，MTT 法检测淋巴细胞刺激指数，ELISA 检测悬液中IFN 水平. 另一部分免疫的 BALB/c 小鼠经尾静脉
8、感染 MTB 毒株H37Rv，4 wk 后计数脾脏细菌负荷数. 结果：MPT64ESAT6 融合蛋白免疫小鼠血清特异性抗体滴度 11500，免疫小鼠后淋巴细胞刺激增殖指数为 2.23，而生理盐水免疫组只有 0.88；脾淋巴细胞悬液中诱发的 IFN 为（4.280.27）g/L，显著高于生理盐水免疫组（0.480.17） g/L，P0.05 ，但不及 BCG 免疫组（5.180.31）g/L. 与生理盐水免疫组（细菌负荷6.450.17）相比较，融合蛋白免疫的小鼠，对攻击感染后抗 MTB在脾脏中增殖有显著作用，细菌负荷为 5.040.11，但与 BCG 免疫组相比脾脏细菌负荷减少甚微（细菌负荷
9、4.380.22）. 结论：MPT64 与 ESAT6 融合蛋白可作为新型结核疫苗的候选组分.【关键词】 结核分枝杆菌；疫苗；MPT64 ；ESAT6 ；融合表达0 引言4ESAT6（Mr 6000 的早期分泌蛋白）和 MPT64 是结核分支杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB ）中重要的保护性抗原, 编码这两种蛋白的基因只存在于 MTB 毒株中而卡介苗（Bacillus Calmette Guerin, BCG）中缺失1 ，研究发现重组的 MPT64 和ESAT6 蛋白免疫小鼠后均可有效抵抗 MTB 感染. 本研究在成功获得MPT64 与 ESAT6 融合蛋白的
10、基础上2 ，研究该融合蛋白在小鼠体内诱导的免疫应答水平和对 MTB 毒株 H37Rv 攻击的保护力.1 材料和方法1.1 材料 MTB 毒株 H37Rv 由陕西省结核病防治研究所王瑞副主任技师惠赠；卡介苗疫苗株由兰州生物制品研究所出品（国药准字 SF20010035，批号 20011201） ；鼠 IFN 和 ELISA 检测试剂盒购自晶美公司；潮霉素（GIBCO BRL 公司）. BCG 培养增强剂（albumindextrosecatalase ADC）和 RPMI 1640 培养基均购自GIBCO 公司. 7H9 液体培养基购自美国 Difco 公司；改良罗氏培养基由本室自制， MTB
11、的培养滤液蛋白(culture filtrate proteins, CFP)由本室制备. 羊抗鼠 IgGHRP 购自华美生物公司. 68 周龄BALB/c 小鼠，雌性，由第四军医大学实验动物中心提供，饲养于第四军医大学动物中心感染实验室.1.2 方法51.2.1MTB 毒株 H37Rv 的培养和定量取罗氏培养基中保存的MTB 毒株 H37Rv 接种到 7H9 培养基（含 100 g/L ADC 和 0.5 g/L Tween80） ，37振摇培养 3 wk，5000 r/min 离心 10 min，收集细菌，保存于-20 备用 . 用 7H9 液体培养基系列稀释浓缩液，接种于罗氏培养基 37
12、培养 2 wk，计数浓缩液细菌的 CFU.1.2.2BCG 的培养和定量取 BCG 疫苗株接种到 7H9 液体培养基（含 100 g/L ADC 和 0.5 g/L Tween 80） ，相同方法培养、收集BCG，并计数细菌的菌落形成单位（colony forming units,CFU）.1.2.3 融合蛋白的大量制备取 MPT64pProEX HTESAT6 阳性克隆2 ，活化后分别接种到 1000 mL LB 培养液中，37 振摇培养至对数生长期，IPTG 诱导，集菌，先进行 SDSPAGE，采用Invitrogen 的 NiNTA 纯化试剂盒纯化目的蛋白，分光光度法测定蛋白浓度.1.2
13、.4 免疫动物实验随机分为 3 组，每组 10 只小鼠，一组用MPT64ESAT6 融合蛋白免疫 BALB/c 小鼠；免疫剂量均为 1 mg/只，共免疫 3 次，第一次和第二次免疫加有不完全福氏佐剂，第三次单纯免疫融合蛋白，每次间隔 2 wk，免疫结束后，收集小鼠血清，用CFP 作为抗原，ELISA 测定免疫小鼠血清特异性抗体滴度 ,其余两组6分别为 BCG 和生理盐水对照组. 最后一次免疫结束后 4 wk，进行以下实验：每组取 5 只小鼠，用于测定淋巴细胞刺激指数(stimulation index, SI)和 IFN 水平；其余 5 只用于毒株攻击实验.1.2.5 脾脏淋巴细胞的分离与制备
14、将免疫的小鼠断颈处死，无菌取脾脏，置于平皿内 200 目的钢网上，用注射器针芯研磨，并加入 RPMI 1640 培养液冲洗. 将上述细胞悬液转入 2 倍体积的淋巴细胞分离液，1000 r/min 离心 20 min. 吸取中间单核细胞层，用RPIM 1640 液洗涤两次后计数.1.2.6 特异性淋巴细胞增殖实验将分离的淋巴细胞浓度调整至5108/L，在 96 孔板中用 100 mL/L FCS 的 RPMI 1640 完全培养液培养，200 L/孔，同时实验组每孔加入 25 L MTB CFP（25 mg/L 溶于 PBS，本室制备） ，对照组不加 CFP，调零孔不加脾细胞，37 50 mL/
15、L CO2 孵箱培养 68 h 后，每孔加 20 L MTT（5 g/L，溶于 PBS，pH 7.2，过滤除菌） ，继续培养 4 h 后弃上清，加DMSO 150 L/孔，振荡 10 min，测定 A490 nm 值. 结果用刺激指数 SI=实验组 A 值/对照组 A 值表示.1.2.7IFN 的诱生及含量的测定 5109/L 脾细胞在 24 孔板用含 10 mL/L FCS 的 RPMI 1640 完全培养液中培养， 800 L/孔，同时加入 MTB CFP 100 L/孔，37 50 mL/L CO2 孵箱培养 72 h，收集培养液，5000 r/min 离心 5 min，取上清，-20冻
16、存备7检. 参照试剂盒说明（夹心 ELISA 法）测定各标本所含 IFN 浓度.1.2.8MTB 毒株 H37Rv 的攻击实验最后一次免疫完成后 4 wk，用 MTB 毒株 H37Rv 经尾静脉感染小鼠，剂量为 105 CFU/只，4 wk 后，断颈处死小鼠，脾脏匀浆，计数细菌 CFU.统计学处理：实验数据以 xs 表示,统计分析采用单因素方差分析，两两比较采用 LSDt 检验, P0.05 有统计学意义.2 结果2.1 小鼠体内特异性抗体滴度 MPT64ESAT6 融合蛋白免疫小鼠三次后血清特异性抗体滴度平均值为 11500.2.2 抗原特异性脾脏淋巴细胞增殖实验分离免疫小鼠的脾脏淋巴细胞，在体外用 CFP 抗原刺激，测定了淋巴细胞的增殖反应，与生理盐水对照组（SI 为 0.88）相比较融合蛋白 MPT64ESAT6 免疫小鼠的脾淋巴细胞增殖明显，SI 为 2.23，BCG 免疫
