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1、1结核分支杆菌 katG 蛋白的高表达与纯化关键词：分支杆菌结核；katG；基因表达；蛋白纯化 【摘要】目的表达与纯化结核分支杆菌 katG 蛋白，为深入研究异烟肼耐药机制奠定基础。方法将含有 katG 基因的pET24b-katG 表达载体转化大肠杆菌 BL21(DE3)菌株，在异丙基硫代-D-半乳糖苷(IPTG)诱导下表达，分别对不同诱导时间的表达产物进行 SDS-PAGE 以及考马斯亮蓝染色。获得稳定的高表达菌株后采用 XpressTM 蛋白纯化系统对超声破菌液进行纯化。最后对纯化产物进行过氧化氢酶活性的初步检测。结果对诱导后的重组大肠杆菌菌液进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SD
2、S-PAGE) 以及考马斯亮蓝染色后发现相对分子质量约为 80000。表达蛋白量约占总蛋白量的 17.7%。对重组 katG 基因表达产物进行纯化的结果发现，以 350mmol/L 咪唑洗脱时的纯化效果最理想，蛋白纯度可达 90%以上。对表达产物进行过氧化氢酶活性初步检测证明，重组的 katG 基因产物具有过氧化氢酶活性。HTH结论通过pET24b-katG 表达质粒转化大肠杆菌可获得基因重组的 katG 高表达菌株，表达产物具有一定酶活性，经纯化后可达到较高的纯度。 Overexpressionandpurificationofcatalase-2peroxidasekatGfrommyco
3、bacteriumtuberculosis 【Abstract】ObjectiveToexpressandpurifythecatalase-peroxidasekatGgenefrommycobacteriumtuberculosis.MethodsPlasmidpET24bcontainingkatGwastransferredintocompetentEscherichiacoliandkatGgenewasoverexpressedbythechallengeofisopropylthio-D-glactoside(IPTG).TheexpressionofkatGproteinwas
4、one-steppurifiedbyXpresssystemTM.Furthermore,thecatalaseactivityofkatGproteinwaspreliminarilydetected.ResultsTherecombinantescherichiacoliproducedkatGproteininlargequantities,accountingfor17.7%oftotalcellprotein.ThemolecularmassofkatGproteinwasestimatedtobe80000bysodiumdodecylsulfate-polyacrylamideg
5、radientgelelectrophresis(SDS-PAGE).Itwasfoundthatimidazoleattheconcentrationof350mmol/LcouldelutethekatGproteinmostefficientlyandyieldthefinalpreparationatgreaterthan90%purity.ThekatGproteinwaspreliminarilydetectedtohavetheactivityofcatalase.ConclusionsThestablekatGoverexpressingrecombinantEscherich
6、iacolicanbeconstructedbytheplasmidpET24bcontainingkatGgene.Therec3ombinantstraincanproducekatGproteinwithcatalaseactivityandtheproductofwhichcanbepurifiedintohigheractivity. 【Keywords】Mycobacteriumtuberculosis;katG;Geneexpression;Proteinpurification 异烟肼(INH) 是一种最经济有效的抗痨药，几乎所有的抗痨方案中均包括 INH。结核分支杆菌编码的
7、katG 基因的突变可致结核分支杆菌对 INH 产生耐药性1 。自 1992 年以来，对于 katG 基因变异或缺失造成分支杆菌对异烟肼耐药的基因水平研究已较为深入1，2 ，有必要在蛋白水平对耐药机制进行进一步研究。本研究将含有 katG 基因的 pET24b-katG 表达载体转化埃希大肠杆菌BL21(DE3)菌株，获得稳定的高表达菌株后进一步对表达产物进行了纯化，并对纯化产物进行了酶活性的初步检测。 材料与方法 一、材料 (一)质粒与菌株 表达质粒 pET24b-katG 与埃希大肠杆菌BL21(DE3)由复旦大学遗传学研究所惠赠。 (二)试剂XpressTM 蛋白纯化系统为美国 Invi
8、trogen 公司产品；异丙基-D 硫代半乳糖苷(IPTG) 为华美生物工程公司产品；其他主要生化试剂为美国 Sigma 公司产品或国内 AR 级产品。 4二、方法 (一)表达载体的转化与基因产物的表达将表达质粒pET24b-katG 转化用氯化钙处理法得到的感受态大肠杆菌BL21(DE3)菌株，将菌株涂于含卡那霉素的 LB 平板上，30C 过夜培养。挑取抗卡那霉素的菌株接种于 20ml 的 LB 培养基(加入 20%的葡萄糖 0.2ml，浓度 50mg/ml 的卡那霉素 40l,浓度 20mg/ml的氯霉素 34l)中，37C，160r/min 振摇过夜。取 3ml 过夜培养物种入 100m
9、l 的 LB 培养基( 含 20%的葡萄糖 1ml，浓度 10mg/ml的卡那霉素 400l，浓度 20mg/ml 的氯霉素 170l)中，37C 以160r/min 振摇，每 20min 测定 1 次 A600 值，直至 A600 值到达0.40.5(勿超过 0.5)。随后每 100mlLB 培养基中加入1mol/LIPTG400l，分别在加入 IPTG 后的第 2、3、4 、5、6h 收集菌液。将菌液在 4C 下，5000g，离心 5min，弃上清。将沉淀物以 10ml 缓冲液(50mmol/LTris.Cl,pH8.0,2mmol/LEDTA,0.1%TritonX-100)重新悬浮，加
10、入溶菌酶(100g/ml) 。在冰浴中以中等强度超声破菌，每次 10s，共 3 次，破菌后，4C，离心 5min，收集上清液备用。 (二)表达产物的十二烷基硫酸钠 -聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测参照文献3进行。收集 IPTG 诱导后的菌液 10l，与加样液 10l 混合，100C 水浴，3min 后点样，25mA 恒流通电进行 SDS-PAGE。电泳后以考马斯亮蓝染色 15min，然后以脱色液脱色观察结果。 5(三)表达产物的纯化 采用 XpressTM 蛋白纯化系统进行纯化。用无菌双蒸水悬浮树脂纯化柱 3 次。加入 7ml 结合液(20mmol/L 磷酸钠，500mmol/L
11、氯化钠， pH7.8)，以及经 IPTG不同时间诱导后产量最高的破菌液上清 5ml，重新悬浮纯化柱。反复轻摇混合 2min。静置 10min，吸弃上清，再加入破菌液上清5ml 重复以上步骤。以 4ml 结合液重新悬浮纯化柱，温和摇动混合2min，静置沉淀，吸弃上清，共 3 次。再以冲洗缓冲液(20mmol/L 磷酸钠，500mmol/L 氯化钠， pH6.0)洗 4 次，分别以不同浓度的咪唑洗脱液(50 、200、350、500mmol/L)各 5ml 加入柱中，收集不同洗脱浓度的洗脱液。将洗脱液进行 SDS-PAGE。将纯化后的蛋白以 85%的硫酸胺沉淀，离心后将沉淀物以无菌双蒸水溶解，4C
12、 透析过夜。透析产物加入甘油 (40%)后贮藏于-80C 的环境下。 (四)过氧化氢酶活性测定 对破菌液上清进行过氧化氢酶活性的初步测定。用磷酸盐(K2HPO4+KH2PO4,0.1mol/L)与NaCl(2mol/L)的缓冲液配制 10%的 Tween80 溶液，取 5ml 与 30%的双氧水 5ml 混合。分对照管与 katG 管，在 katG 管内加入不同容积的含 pET-katG 表达质粒的菌株破菌上清(20 、40、80、160l)，对照管则加入含 pET 空载体的菌株破菌上清，10min 后观察气泡产生情况。如产生大量气泡则提示酶活性较佳。 结果 一、重组 katG 蛋白的诱导表达
13、以及产物的鉴定分析 6将含有 katG 基因的 pET24b-katG 表达质粒转化大肠杆菌，在 IPTG 诱导下表达，分别对不同诱导时间的表达产物进行 SDS-PAGE 以及考马斯亮蓝染色，可在相对分子质量 80000 处见一诱导表达带(图 1)。比较不同诱导时间的表达产量可以发现，经诱导 2h后的表达产量已达到峰值。在其后蛋白纯化中即可选取该诱导时间的产物。对此诱导表达带进行黑度密度自动扫描分析，此处表达蛋白量约占总菌体蛋白量的 17.7%。 二、重组 katG 基因表达产物的纯化结果 采用 XpressTM 蛋白纯化系统进行纯化发现，分别以不同浓度的咪唑洗脱液(50、 200、350、5
14、00mmol/L)洗脱纯化柱后，所收集的洗脱液再次进行 SDS-PAGE 分析。结果发现，以350mmol/L 咪唑洗脱后纯化的效率最高，通过 SDS-PAGE 黑度密度自动扫描分析可以发现纯化率可达 90%以上。 三、对 katG 基因表达产物的过氧化氢酶活性测定结果 在过氧化氢反应系统中加入不同容积的破菌上清(20、40、80、160 、 320l)，比较气泡产生情况，发现加入含pET-katG 表达质粒的菌株破菌上清的各管均有气泡产生，且均较对照管为明显，而以加入量为 160l 与 320l 的反应管产生气泡最为显著。提示重组 katG 表达产物具有过氧化氢酶活性。 讨论 结核分支杆菌的
15、 katG 在 INH 的抗结核作用机制中起着关键作用。研究表明 INH 实际上是一个药物前体，需经结核分支杆菌过7氧化氢酶-过氧化物酶活化后才发挥抗结核作用，而 katG 则由 katG基因所编码4 。有研究通过质粒将 katG 基因转移到 INH 耐药菌株胞内，可令其对 INH 重新恢复敏感性。而对结核分支杆菌的临床耐异烟肼菌株进行 katG 基因分析亦发现该基因的缺失或突变是引起耐药的主要原因5 。然而对于 katG 如何活化 INH 以及 katG发生变异后导致耐药的确切机制仍然不清，特别是近年来对于不同突变位点变异对药物敏感性的影响程度颇有争议6 ，因此在蛋白水平研究 katG 的作
16、用环节与耐药机制，以及比较不同位点基因突变对酶结构与活性的影响等方面进行研究可深入了解 INH 耐药的发生机制，进而可能在蛋白水平找到消除耐药的途径。由于结核分支杆菌生长较缓，而且具有较强的传染性，长期以来在提取结核分支杆菌蛋白进行研究的进展较缓。本研究通过基因重组的 katG 表达载体转化到大肠杆菌后产生高表达的 katG 蛋白，相对分子质量约为 80000，表达量可占总菌体蛋白的 17.7%。表明该基因重组的菌株为 katG 的高表达菌株，对表达产物进行初步过氧化氢酶活性研究验证了其酶活性。进一步对表达产物进行纯化后可提取到纯度超过 90%的 katG 蛋白。本研究为进一步研究 katG 蛋白、katG 对异烟肼的活化机制以及为检测 katG 变异耐药菌株奠定基础，并且对深入阐明 INH 的耐药产生机制与寻求消除耐药的方法有较大的意义。参考文献1，Rouse DA, Li Z, Bai GH, et al.
