《糖尿病大鼠肺泡巨噬细胞TLR2的表达及对PG反应性的研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《糖尿病大鼠肺泡巨噬细胞TLR2的表达及对PG反应性的研究（6页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1糖尿病大鼠肺泡巨噬细胞 TLR2 的表达及对 PG 反应性的研究【摘要】目的观察糖尿病大鼠肺泡巨噬细胞 Toll 样受体2（TLR2）的表达水平及其对肽聚糖（PGN）反应性的变化，探讨该变化在糖尿病机体防御病原体感染中的作用。方法将 32 只Wistar 雄性大鼠用随机数字表法分为正常组（A 组） ，糖尿病组（B组） ，正常+ PGN 组（C 组）及糖尿病+ PGN 组（D 组） 。用免疫细胞化学方法、逆转录一聚合酶链反应(RT PCR)法检测各组大鼠肺泡巨噬细胞 TLR2 表达的变化。结果B 组及 C 组大鼠肺泡巨噬细胞 TLR2 表达与 A 组相比均明显增高（ P0.05） ；D 组大鼠
2、肺泡巨噬细胞 TLR2 表达较 B 组及 C 组升高更为明显，糖尿病与脂多糖刺激存在交互作用（P0.05 ） 。结论糖尿病大鼠肺泡巨噬细胞TLR2 表达明显增高，提示糖尿病机体处于促炎症状态,而且我们发现糖尿病与肽聚糖刺激在使 TLR2 表达增高方面存在交互作用。 【关键词】toll 样受体 2糖尿病肽聚糖 Toll 样受体 (Toll2like receptors,TLRs)是近年来新发现的一种同源于果蝇 Toll 的蛋白分子，TLRs 能够对病原体识别、结合、引发一系列信号间的转导,促进各种炎性介质的释放,在早期启动固有免疫应答 对宿主的天然免疫防御具有重要作用1 。TL R 与天然免疫应
3、答关系的研究中,倍受关注的是 TL R2 和 TL R4。近期人们对TLRs 信号传导途径在糖尿病及其并发症的发生发展中所起的作用日2渐重视2，但对于糖尿病感染患者 TOLL 受体的作用我们还知之甚少，此次实验我们研究了肽聚糖刺激下 TLR2 在正常大鼠及糖尿病大鼠肺泡巨噬细胞表达，希望能进一步了解糖尿病病人免疫系统功能的变化。 1 材料与方法 1.1 材料 健康雄性 Wistar 大鼠 32 只，SPF 级，鼠龄 12 周，体重（20020）克，购于中国医科大学实验动物室,链脲佐菌素: 美国sigama 公司，PGN( staphylococcus aureus) : Sigma 公司, 谷
4、氨酰胺、小牛血清 FCS 、D 2Hanks 液、RPM I1640: Hyclone 公司;兔抗鼠 TLR2:美国 SANTA CRUZ 公司。 1.2 方法 1.2.1 将 32 支雄性 Wistar 大鼠随机分为 4 组：正常对照组（A组,n=8） ，糖尿病组（B 组,n=8）, 正常PGN 组（C 组,n=8 ） ，糖尿病PGN 组（D 组,n=8） 。 糖尿病组一次性腹腔注射链脲佐菌素 60mg/kg 体重，对照组注射同等剂量枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液，72 小时后随机血糖16.67mmol/L 为糖尿病模型成功，以后每周复查 1 次血糖,连续观察 4 周3。 1.2.2 免疫细胞化学
5、染色：采用免疫细胞化学染色 SABC 法，染色时兔抗鼠 TLR2 的浓度为 1：200 。阳性反应为胞膜和胞浆呈棕黄色着色。各组切片测定阳性细胞单位面积平均光密度值。 31.2.3 TLR2mRNA 表达测定: 引物委托上海生物工程服务有限公司合成,引物序列如下：上游引物 5-CTAAAGTCGATCCGCGACATC-3，下游引物 5-TTCATCAGTGAGAACCGAGC-3，扩增长度为 213bp(580792)，内参照物 -actin 引物 :上游引物 ACTGCCGCATGGTG TTCCTG,下游引物 AA GCACTTGCGGTGCACGA。将 Tripure 试剂 1mL 加
6、入培养皿中，以下步骤按照 Tripure 试剂说明要求进行。逆转录 聚合酶链反应( RTPCR) 严格按照试剂盒说明书进行操作。取各样本 RTPCR 产物 10L 加样(-actin5L) 和 1L 上清缓冲液混匀后加于 2%琼脂糖凝胶电泳槽齿孔中 ,50V 恒压电泳 30min,取胶置凝胶成像系统中拍照,结果扫入电脑备处理。 1.2.4 统计分析：电泳条带比密度值以灰度面积/参照物表示,采用 SPSS13.0 统计软件处理，实验数据用 x-s 表示，各组间指标比较用双因素双水平析因分析，P0.05 为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 免疫细胞化学结果 A 组大鼠肺泡巨噬细胞可见弱的 TL
7、R2 表达，以胞浆及胞膜为主呈较淡的棕黄色改变（见图 1） ；B 组细胞 TLR2 在上述部位表达渐增多，在胞浆及胞膜呈金黄色改变（见图 2） ；C 组及 D 组细胞的胞浆及胞膜呈深棕黄色改变，且可见部分细胞胞浆淡染、肿胀，部分细胞胞核形态不规则，部分细胞变性坏死（见图 3 及图 4） 。42.2TLR2 mRNA 表达变化 TLR2 和内参照物 actin 扩增后的片段分别为 293 bp、439 bp。与 A 组（0.1130.017）相比，B组（0.2110.06） 、C 组（0.3310.04 ） 、 D 组（0.4950.019）的TLR2 mRNA 表达水平依次增加，差异显著（见图
8、 5） 3 讨论 免疫系统保护我们免于自然界病原菌的侵害，Toll 样受体在固有免疫中占据重要地位。目前其家族成员至少有 11 个4, 其中 TL R2具有相对广泛的配体特异性 ,可识别多种病原体相关分子模式 (pathogen associated molecular patterns , PAMPS)。近年来随着糖尿病人数日益上升，死于感染等并发症的也急剧增多，此次实验我们发现高血糖水平改变了 Toll 样受体的表达，在无 PG 刺激时TLR2 在糖尿病大鼠肺泡巨噬细胞表达较对照组增高；PG 刺激后TLR2 在糖尿病大鼠肺泡巨噬细胞的表达进一步增高，PG 刺激与糖尿病在使 TLR2 表达升
9、高方面存在交互作用，提示糖尿病机体处于促炎症状态，TLR2 表达增加与糖尿病对炎症反应的失控关系密切，糖尿病人多发感染考虑与此有关，与此相同的是，Devaraj S5等证实糖尿病患者单核细胞中 TLR2,TLR4 的表达增加，及Mnhammad 等6报道在新发病非肥胖型糖尿病大鼠骨髓巨噬细胞 TLR2、TLR3 、TLR4 和 TLR5 升高，同时 IL12P40、NF-B、IL-6 及内源性 NO 均升高。 总之，糖尿病患者的免疫系统发生改变，Toll 样受体在其中发挥5着重要的作用,了解 TLRs 将可能对于糖尿病及其并发症的治疗及预防有重要的意义。 参 考 文 献 1Medzhitov
10、R，PrestonHurlburt P，Janeway CA A human homologue of the Drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunityNature，1997,388(6640):394-397 2Kanczkowski W, Ziegler CG, Zacharowski K, Bornstein SR. Toll-like receptorsinendocrinedisease and diabetes.Neuroimmunomodulation.2008;15(1):54-60. Epu
11、b 2008 Jul 29Epub ahead of print. 3SuthagarE,SoundamaniS,YuvarajS,etal.Effectsofstreptozotocin-induced diabetes and insulin replacement on rat ventral prostate.Biomed Pharmacother. 2008 Feb 11 Epub ahead of print. 4杨芳芳，陈成水.Toll 样受体 2 的研究进展J.医学综述,2008,11:l4. 5Devaraj S,Dasu MR,Rockwood J,et al. Incre
12、ased Toll-Like Receptor (TLR) 2 and TLR4 Expression in Monocytes from Patients with Type 1 Diabetes: Further Evidence of a Proinflammatory State.sJ Clin Endocrinol Metab. 2008 6Feb;93(2):578-83. 6Mohammad MK, Morran M, Leaman DW, Dysregulated Toll-like receptor expression and signaling in bone marrow-derived macrophages at the onset of diabetesinthenon-obesediabeticmouse.IntImmunol,2006, 18(7):1101-13.
