《大肠杆菌表达体系介绍ppt课件.pptx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《大肠杆菌表达体系介绍ppt课件.pptx（91页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、蛋白表达系统 1 表达系统背景 工业酶 应用 应用 应用 应用 洗涤酶 纺织酶 饲料酶 果汁酶 烘焙酶 酿造酶 工业酶与我们的日常生活息息相 关 2 市场 摘自novozymes 2012年报 1 市场容量小 全球市场约250 300亿元人民币 2 产能大 价低 技术密集型 3 市场需求 纺织酶 从全球来看 纺织酶大概占酶制剂行业10 左右 规模在2 5亿元美金 中国市场目前市场规模在6 个亿左右 但主要为外资占据 国内企业基本处于竞争弱势 但国内市场将会维持持续高增长 纤维素酶 尤特尔 夏盛 江西博兰 高宝 康地恩 蔚蓝 中温淀粉酶 江阴百圣龙 杰诺 其他淀粉酶公司 除氧酶 无 几家企业在产
2、业化开发中 江南大学的技术 碱性果胶酶 无 几家企业在产业化开发中 江南大学的技术 典型企业 目前市场增长 15 左右 市场预期 市场格局 4 纺织酶主要品种市场预期及发展现状 品种功能使用条件最优使用条件产业化情况预期市场 淀粉酶低温退浆酸性条件 40 80oC 宽温宽pH国内 国外酶均 有 稳步增长 纤维素酶抛光 牛仔水 洗 柔软整理 酸性 4 5 5 5 近中性 5 5 6 5 近中性 作用效果 优 失重小 酸性国内国外均 有 中性国内尚 未产业化 稳步增长 当前是纺织 酶中市场最大 除氧酶漂白后除氧不调pH值 碱性条 件下 宽温宽pH国外有 国内目 前江南大学产业 化初步阶段 稳步增长
3、 3000吨 果胶酶精炼碱性碱性条件诺维信等少数国 际公司产业化 国内产业化初步 阶段 市场空间较大 5000吨 漆酶牛仔水洗 低温皂洗 染料废水脱色 酸性近中性目前尚无商业化 成本高 未来皂洗 染料废水脱 色市场空间大 5 市场需求 动物饲料酶 从长远来看 饲料仍然有较大的市场发展空间 其将在一定时间内保持较高增长 而从目 前产品结构来看 植酸酶在饲料市场占有较高的份额 广东溢多利 我国最大的动物饲料酶公司 北京昕大洋 植酸酶生产及制剂 挑战集团 植酸酶的龙头企业 及动物饲料和饲料添加剂 其他 康地恩 新华扬 夏盛等公司 典型企业 市场产品结构 市场空间 吨 6 品种功能使用条件最优使用条件
4、产业化情况预期市场 植酸酶降解饲料中有机 磷 减少无机磷 的添加 酸性条件 pH2 6 5 37oC动 物肠胃环境 宽pH 酸近中性 热 稳定好 低温37oC活 力高 国内成功实现产业化 且活力不断提高 主要 是国产酶 需求量稳步增长 市 场潜力大 产能盲目 扩张导致价格下降 木聚糖酶降解饲料中木质 素 同上宽pH 酸近中性 热 稳定好 低温37oC活 力高 自主产业化 改变依靠 进口的局面 活力高 稳步增长 纤维素酶降解饲料中纤维 素 同上同上小品种酶 主要用于复 合酶 国内有产业化 稳步增长 但量小 淀粉酶水解淀粉类饲料同上同上小品种酶 主要用于复 合酶 国内有产业化 稳步增长 但量小 蛋
5、白酶蛋白类饲料同上同上小品种酶 主要用于复 合酶 国内有产业化 稳步增长 但量小 非淀粉多 糖酶 NSP 非淀粉类多提 果胶 木聚糖 甘露聚糖 葡聚 糖等 同上同上除木聚糖酶外 国内实 现产业化 其他需进口 稳步增长 但量小 动物饲料酶 7 市场需求 其它领域 中国在洗涤剂用酶行业发展一直较为缓慢 主 要是与特定的洗涤方式和洗涤剂的形式决定的 如 洗涤剂主要还是以粉状为主 液体较少 而事实上 液体洗涤剂中酶的加入更容易 更普遍 且更易洗 涤 此外 中国更多是冷水洗涤 20oC左右 而欧 美的洗涤温度30 40oC 而国内当前低温洗涤用酶 的开发很少 因而洗涤用酶市场需求并未得到有效 激发 洗涤
6、用酶 淀粉深加工酶 食品用酶 其它用酶 如新能 源 皮革 造纸等领 域 在淀粉加工行业 酶作为重要的必要的催化剂 其需求将保持持续稳定 如糖化酶 市场稳 定 供过于求 淀粉酶 高品质酶有需求 需 求稳定 葡萄糖异构酶 市场需求稳定 普鲁 兰酶 市场需求稳定 酶在其它新兴领域 如新能源等领域有着潜在的市 场需求 目前一些企业正在开发 但基本都处在研 发阶段 如DSM 诺维信 杰能科 DSM 美国市场 中试乙醇厂 纤维素酶 辅酶 化学工艺相结 合 诺维信 国内与中粮战略合作 中试工厂 杰 能科 Dupont 合作生产纤维素乙醇 国内一些厂 家也在开发试验 如中科院过程所 中科院微生物 所 天津工生
7、所 山东大学等 其它领域 如皮革 造纸等领域也正逐渐兴起 随着食品工业与酶制剂行业的发展 特别是绿 色 高质量食品将对酶制剂表现出持续的需求 如糖化酶 淀粉酶 低聚糖等在果汁加工 酿造 肉类处理 啤酒等行业有着广泛的需 求 8 常用微生物表达系统 类类型菌株 原核Escherichia coli Bacillus subtilis Pseudomonas fluorescens荧光假单胞菌 Streptomyces lividans变铅青链霉菌 Lactococcus lactis乳酸乳球菌 酵母 Hansenula polymorpha汉逊酵母 Kluyveromyces lactis乳酸克
8、鲁维酵母 Pichia pastoris Saccharomyces cerevisiae 丝状真菌 Chrysosporium lucknowense Neurospora crassa链孢霉 Trichoderma reesei瑞氏木霉 Aspergillus niger oryzae 9 表达系统 工业生产 菌株 发酵工艺和后提取方法等 摘自 Microbial Expression Systems and Manufacturing from a Market and Economic Perspective The good production strain is not ever
9、ything but everything is nothing without a good production strain 菌株 诱变选育高产菌和基因工程菌 10 工业酶表达系统特点 酶蛋白高效表达系统 是酶制剂开发和应用最关键的技术 工业化应用的表达系统评价的四个指标 转 化 筛 选 遗 传 稳 定 蛋 白 种 类 放 大 易操作性 发 酵 原 料 发 酵 工 艺 和 后 处 理 可延展性 副 产 物 少 表 达 量 高 低成本性 高效表达 11 常用工业酶表达系统的表达水平 种类菌名 表达水平 举例 目的蛋白总蛋白 细菌 大肠杆菌 7g l 枯草芽孢杆菌20g l淀粉酶 蛋白酶 酵
10、母毕赤酵母 7 10g l 20g l木聚糖酶 植酸酶等 丝状真菌 黑曲霉50g l糖化酶 米曲霉50g l淀粉酶 里氏木霉80g l纤维素酶 金孢子菌C1100g l纤维素酶 12 u大肠肠杆菌蛋白表达系统统 u枯草芽孢孢杆菌蛋白表达系统统 u酵母蛋白表达系统统 u丝丝状真菌蛋白表达系统统 13 外源基因在大肠杆菌中的表达 14 外源基因在大肠杆菌中的表达 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征 大肠杆菌表达外源基因的优势 全基因组测序 共有4405个开放型阅读框架 基因克隆表达系统成熟完善 繁殖迅速 培养简单 操作方便 遗传稳定 被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物 15 外源基因在大肠
11、杆菌中的表达 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征 大肠杆菌表达外源基因的劣势 缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白 细胞周质内含有种类繁多的内毒素 16 外源基因在大肠杆菌中的表达 外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理 启动子 终止子 核糖体结合位点 密码子 质粒拷贝数 转录水平 翻译水平 17 P tac 3 P trp 11 P lac 启动子 35 区序列 10 区序列 P lacT T T A C A T A T A A T P trp T T G A C AT T A A C T P tacT T G A C A
12、T A T A A T P traA T A G A C A T A A T G T P lLT T G A C A G A T A C T P recAT T G A T A T A T A A T 启动子 18 转录调控机理 具有多顺反子结构 基因排列次序为 启动子 lacP 操纵基因 lacO 结构基因 lacZ lacY lacA 正调节因子 CAP 负调节因子 lac I 启动子 Lac 表达系统 以大肠杆菌 lac 操纵子调控机理为基础设计 构建的表达系统 19 lacI Plac lacO lacZ lacY lacA 高效转录 cAMP CAP lacI Plac lacO l
13、acZ lacY lacA RNA 聚合酶 基底水平转录 Lac 表达系统 正调节因子 CAP cAMP激活CAP CAP cAMP复合物与 lac 操纵子上专一位点结合 后 能促进 RNA 聚合酶与 35 10 序列的结合 进而促进 Plac 介导的转录 RNA 聚合酶 RNA 聚合酶 基因工程中使用的 lac 启动子均为抗葡萄糖代谢阻遏的突变型 即 Plac UV5 cAMP 葡萄糖代谢 cAMP浓度降低 cAMP CAP CAP 20 Lac 表达系统 lac UV5 突变体 Plac UV5 突变体能够在没有 CAP 存在的情形下非常有效的起始 转录 受它控制的基因在转录水平上只受 l
14、acI 的调控 因此用它 构建的表达载体在使用时比野生型 Plac 更易操作 21 Lac 表达系统 负调节因子 lac I 在无诱导物情形下 lacI 基因产物形成四聚体阻遏蛋白 与启动 子下游的操纵基因紧密结合 阻止转录的起始 lacI Plac lacO lacZ lacY lacA RNA 聚合酶 基底水平转录 lacI Plac lacO lacZ lacY lacA 高效转录 RNA 聚合酶 IPTG mRNA 22 Tac 表达系统 tac 启动子是由 trp 的 35 序列和 lacUV5 的 10 序列拼接而成的杂 合启动子 调控模式与 lacUV5 相似 但 mRNA 转录
15、水平更高于 trp 和 lacUV5 启动子 P tac 3 P trp 11 P lac 因此在要求有较高基因表达 水平的情况下 选用 tac 启动子比用 lacUV5 启动子更优越 启动子 35 区序列 10 区序列 P lacT T T A C A T A T A A T P trp T T G A C AT T A A C T P tacT T G A C AT A T A A T 23 lac tac 启动子对宿主菌的要求 在普通大肠杆菌中 LacI 阻遏蛋白仅能满足细胞染色体上 lac 操纵子 转录调控的需要 当多拷贝的 lacO 随着带有 lacUV5 tac 启动子的表达质粒转
16、化进入 大肠杆菌后 LacI 阻遏蛋白与 lacO 的比例显著下降 无法保证每一 个 lacO 都能获得足够的 LacI 阻遏蛋白参与转录调控 表现为在无诱 导物存在的情形下 lacUV5 tac 启动子有较高的本底转录 24 lac tac 启动子对宿主菌的要求 为了使以 Lac Tac 表达系统具有严紧调控外源基因转录的能力 一 种能产生过量的 LacI 阻遏蛋白的 lacI 基因的突变体 lacIq 被应用于表 达系统 大肠杆菌 JM109 等菌株的基因型均为 lacIq 常被选用为 Lac Tac 表达系统的宿主菌 但是这些菌株也只能对低拷贝的表达载体实现严紧调控 在使用高拷 贝复制子构建表达载体时 仍能观察到较高水平的本底转录 需在表达载体中插入 lacIq 基因以保证有较多的 LacI 阻遏蛋白产生 25 lac tac 表达系统存在的问题 IPTG 用于诱导 lac tac 启动子的转录 但由于 IPTG 本身具有一定的 毒性 从安全角度 对表达和制备用于医疗目的的重组蛋白并不适合 一些国家规定在生产人用重组蛋白质的生产工艺中不能使用 IPTG 解决方法 lac 和 ta
