《端粒酶RNA特异性核酶抑制卵巢癌细胞端粒酶的活性》由会员分享，可在线阅读，更多相关《端粒酶RNA特异性核酶抑制卵巢癌细胞端粒酶的活性（7页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1端粒酶 RNA 特异性核酶抑制卵巢癌细胞端粒酶的活性作者：王红英辛晓燕马越云苏明权 【关键词】 卵巢肿瘤 关键词: 卵巢肿瘤;端粒，末端转移酶; 核糖核酸酶类 ;转染 摘 要:目的 研究端粒酶 RNA 特异性核酶对卵巢癌细胞活性的抑制作用. 方法 用脂质体法将构建好的核酶逆转录病毒载体转染至卵巢癌 HO-8910 细胞，以 MTT 比色法检测细胞的生长，应用流式细胞仪分析细胞周期细胞，观察细胞的增殖情况，同时扩增端粒重复序列，结合杂交分析，检测细胞的端粒酶活性. 结果 MTT 检测发现转染核酶后的细胞生长的潜伏期延长（4872h） ，对数生长期减缓（45d） ，流式细胞仪结果显示其 G1 期
2、比例明显增高（70.0%80.5%，P0.01） ，S 期细胞比例明显降低（19.0%13.7%，P0.01） ，细胞增殖下降，细胞的端粒酶活性亦降低. 结论 端粒酶 RNA 特异性核酶能抑制卵巢癌细胞端粒酶活性，抑制细胞增殖. Keywords:ovarian neoplasms;telomere，terminal trans-ferase;ribonucleases;transfection 2Abstract:AIM To explore the effects of hammerhead ri-bozyme against human telomerase RNA in ovarian
3、 carcinoma cells.METHODS We transfected the ribozyme directed a-gainst the RNA component of human telomerase into HO-8910，human ovarian carcinoma cells.Then we observed thepropagation of the cells with MTT，analyzed cell cycle phases under FCM and detected their telomerase activity by TRAP-Hyb Kit.RE
4、SULTS After transfection，we found that the latent period of the transfected cells prolonged（4872h）and the logarithm growth period also lengthened（45d）.FCM showed that cells in G1phase increased obviously（70.0%80.5%，P0.01 ）and decreased obviously in S phase（19.0%13.7%，P0.01）.The propagation of the ce
5、lls was inhibited and the telomerase activity was reduced.CONCLUSION Telomerase ribozyme inhibites the telom-erase activity in ovarian carcinoma cells. 0 引言 核酶（ribozyme，RZ）通过合理的设计及操作，特异地剪切靶 RNA，可以作为治疗人类恶性肿瘤的手段之一1，2 .Li 等3 利用逆转录酶抑制剂对卵巢癌细胞作用后发现细胞端粒酶活3性明显抑制，细胞的 G2 /M 期 DNA 含量明显升高.研究表明，针对端粒酶的肿瘤基因治疗可能是一条
6、有效的治疗肿瘤的新途径.我们研究核酶对卵巢癌细胞端粒酶活性的作用. 1 材料和方法 1.1 材料 卵巢癌细胞系 HO-8910 由本室保存; 脂质体购于Life Technologies 公司 ;生物素标记试剂盒购于 NEB 公司;胎牛血清、G418、四唑盐（MTT） 、亲和素、生物素标记辣根过氧化物酶、端粒酶活性检测试剂盒（TRAP-Hyb Kit）均购于华美生物工程公司;真核表达载体 pcDNA3 由西京医院临床分子实验室提供.端粒酶特异性核酶由西京医院临床分子实验室构建，经全自动序列分析仪检测序列正确.针对 hTR 模板区设计一锤头状核酶，人工合成后，重组至克隆载体，酶切鉴定及序列分析检
7、测正确，酶切回收后，定向克隆入真核表达载体 pcDNA3，酶切鉴定序列正确. 1.2 方法 用含 100mL L-1 胎牛血清， 1105 U L-1 青霉素和 1105 U L-1 链霉素的 1640 培养基，37，50mL L-1 CO2 孵箱培养卵巢癌 HO-8910 细胞.脂质体介导的基因转染参照试剂说明书进行:细胞分成 3 组:试验组:HO-8910 细胞转染核酶载体-HO-8910/pRZ;阴性对照:HO-8910 细胞转染空的 pcDNA3-HO-8910/pcDNA3;空白对照 :HO-8910 细胞.将处于良好生长状态的4HO-8910 细胞接种在 6 孔板中，加入 100m
8、L L-1 1640 培养基2mL，37，50mL L-1 CO2 培养至细胞 50%汇合时供转染使用.转染前先吸弃培养液，用不含血清及抗生素的培养液洗细胞 1 次，加入脂质体-DNA 复合物（每孔含培养液 1mL，脂质体 10g，质粒 DNA2g） ，于 37，50mL L-1 CO2 孵箱中培养 5h，加含200mL L-1 胎牛血清的培养液 1mL 继续培养 1824h ，更换新的100mL L-1 1640 培养基，继续培养 2472h ，用含 1g L-1 G418的完全培养液培养，进行细胞筛选.提取细胞的 RNA，以生物素标记核酶的 cDNA 链作为探针，进行斑点杂交检测细胞内转录
9、情况.用四唑盐比色试验检测细胞活力，参照文献4进行.细胞端粒酶活性检测参照端粒酶 TRAP-Hyb Kit 说明书进行.样本 A490nm 值大于或等于阴性对照 A490nm 值的 2.1 倍时，为端粒酶活性阳性.阴性对照为同体积裂解液加入反应.收集转染后第 3 代细胞（5105 ） ，1000r min-1 离心 10min，0.01mol L-1 ，pH7.3PBS 洗 1 次，加入 1mL-20预冷的 700mL L-1 乙醇固定，4过夜.次日用0.01mol L-1 PBS 洗 1 次，加入 PI300L 染色 30min，在 ELITE-流式细胞仪上测定细胞周期. 统计学方法: 检验
10、. 2 结果 5HO-8910/pRZ 细胞斑点杂交显示转染成功（Fig1）.细胞活力检测结果表明试验组细胞的潜伏期及对数生长期分别为 72h 及5d，对照组为 48h 及 4d.实验组细胞的潜伏期延长，对数生长期明显减慢（Fig2）. 各组细胞 A490nm 值分别为:阴性对照 0.056，阳性对照 0.119，HO-8910/pRZ 细胞 0.105，HO-8910/pcDNA 细胞 0.141，HO-8910 细胞 0.163.分别为阴性对照的1，2.13，1.88，2.52 及 2.91 倍，结果判定分别为 :HO-8910/pRZ细胞为阴性，HO-8910/pcDNA 细胞及 HO-
11、8910 细胞为阳性.HO-8910/pRZ 细胞的端粒酶活性较对照组明显减低，转染空载体的细胞（HO-8910/pcDNA3 ）端粒酶活性与未转染细胞比较则变化不明显. 流式细胞仪检测结果表明 HO-8910/pcDNA3 细胞中处于 G1期，S 期的细胞比例分别为 70.0%和 19.0%，HO-8910/pRZ 细胞分别为 80.5%和 13.7%.核酶作用后，G1 期细胞比例明显增高，S 期细胞比例明显降低（P0.01 ）.细胞的分裂、增殖受到明显抑制 . 图 1 图 2 略 3 讨论 核酶为基因的表达与调控的研究及抗病毒、抗肿瘤的基因治疗提供了新的思路和手段4 .Duggan 等5
12、报告，端粒酶阳性预测肿瘤细胞存在的敏感率达 88%.Novakovic 等6 检测卵6巢癌端粒酶 RNA 敏感率为 71.4%.抑制端粒酶的活性成为治疗肿瘤的可能途径，Du 等7 通过端粒酶催化亚单位（hTERT）基因的反义寡核苷酸抑制肿瘤细胞的端粒酶活性;Zhang 等8 应用反义端粒酶 RNA 有效抑制了肝癌细胞的端粒酶活性同时显著促进细胞凋亡.我们将针对 hTR 模板区的锤头状核酶，转染至卵巢癌细胞HO-8910 后，发现细胞的端粒酶活性明显降低，活力明显减弱，细胞的分裂增殖明显抑制，与其对宫颈癌细胞及内膜癌细胞的作用结果一致.本结果提示端粒酶特异性核酶明显抑制卵巢癌细胞的增殖，为进一步
13、开展卵巢癌的基因治疗奠定基础. 参考文献: 1Fan YD，Li KZ，Zhao YT.Effect of bcl-2mRNA-cleaving ri-bozyme on tumorogenicity of cholangioma cells in nude mice J.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ） ，2000;21 （12）:1479-1481. 2Fan YD，Li KZ，Zhao YT.The morphological transform of apoptosis in human cholangiocarcinoma
14、 cells induced by bcl-mR-NA-cleaving ribozyme J.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ） ，2000;21（3 ）:324-327. 3Li HM，Xin XY，Du H，Wang J，Wang DT.AZT inhibits telomerase activity of tumor cells J.Di-si Junyi 7Daxue Xue-bao（J Fourth Mil Med Univ） ，2001;22（2）:119-121. 4Perry PJ，Arnold JR，Jenkins
15、 TC.Telomerase inhibitors for the treatment of cancer:The current perspective J.Expert Opin Investig Drugs，2001;10（12 ）:2141-2156. 5Duggan BD，Wan M，Yu MC，Roman LD，Muderspach LI，Delgadillo E，Li WZ，Martin SE，Dubeau L.Detection of ovari-an cancer cell:Comparison of a telomerase assay and cytologicexami
16、nation J .J Natl Cancer Inst，1998;90（3）:238-242. 6Novakovic S，Fras PA，Jezersek-Novakovic B.Telomerase ac-tivity as a biological marker in some gynecological tumors:Com-parison with tissue and serum CA125J.In Vivo，2001;15 （4）:327-332. 7Du H，Xin XY，Wang J.Attenuation of telomerase activity by an antisense oligonucleotide against hTERT mRNA in ovarian cancer cells J .Di-si
