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1、三氧化二砷对MRL lpr 狼疮小鼠脾脏CD4 T 细胞IFN 和IL 4基因 启动子甲基化的影响 研究背景 系统性红斑狼疮 病因发病 机制未明 多器官 多系统受累 激素 免疫抑 制剂治疗为主 大量自身 抗体产生 系统性红斑狼疮 系统性红斑狼疮发病机制 SLESLE T B 细胞的过度活化细胞的过度活化 T细胞DNA呈低甲基化 DNA甲基化酶的活性下降 自身抗体 免疫复合物形成 IFN 和IL 4明显升高 系统性红斑狼疮发病机制 目前认为 DNA甲基化和组蛋白乙酰 化等表观遗传学机制在系统性红斑狼疮的 发病机制中起重要作用 三氧化二砷 ATO 的临床应用 我国自1992年率先采用亚砷酸治疗急性
2、早幼粒细 胞白血病获得成功 缓解率高 副作用小 美国FDA于2000年批准ATO注射液上市作为复发 性急性早幼粒细胞白血病的二线治疗药物 Leoni F Gianfaldoni G Annunziata M et al Arsenic trioxide therapy for relapsed acute promyelocytic leukemia a bridge to transplantation J Haematologica 2002 87 5 485 489 ATO研究进展 ATO能通过改变DNA甲基化水平来影响 调控基 因的转录 如 促进多种肿瘤基因 bcl 2 p53 p16
3、等 启动子的甲基化 2006年法国学者Pierre Bob 等在 BLOOD 杂 志上发表论文提出ATO对狼疮鼠有治疗作用 Bobe P Bonardelle D Benihoud K et al Arsenic trioxide A promising novel therapeutic agent for lymphoproliferative and autoimmune syndromes in MRL lpr mice J Blood 2006 108 13 3967 3975 本课题组研究基础 体内 研究 ATO对BXSB狼疮小鼠有免疫抑制作用 体内 研究 ATO能降低发病早 晚期
4、的MRL lpr小 鼠血清抗ds DNA抗体 IFN 和IL 4的 水平 体外 研究 ATO能抑制MRL lpr狼疮鼠CD4 T细 胞的增殖 降低其IFN 和IL 4的基因 转录和翻译水平 ATO能提高MRL lpr狼疮鼠脾脏及淋 巴结的DNA甲基化水平 体内 研究 研究目的 研究目的 MRL lpr狼疮小鼠和C57小鼠脾脏CD4 T细胞IFN 和IL 4基因启动子甲基化的对比 观察ATO对MRL lpr狼疮小鼠脾脏CD4 T细胞 IFN 和IL 4基因启动子甲基化的影响 探讨ATO对SLE的治疗机制 及其逆转MRL lpr 狼疮小鼠IFN 和IL 4基因启动子低甲基化之间 的关系 实验方法
5、动物模型 MRL lpr小鼠 含有与细 胞凋亡有关的Fas基因隐性 突变 症状与人类红斑狼 疮相似 包括显著的血清 自身抗体 免疫复合物肾 小球肾炎 血管炎等 其 发病年龄约为10 12周 Santiago Raber ML Laporte C Reininger L et al Genetic basis of murine lupus J Autoimmun Rev 2004 3 1 33 39 Mizugaki M Yamaguchi T Ishiwata S et al Alteration of DNA methylation levels in MRL lupus mice J C
6、lin Exp Immunol 1997 110 2 265 269 Sawalha AH Jeffries M Defective DNA methylation and CD70 overexpression in CD4 T cells in MRL lpr lupus prone mice J Eur J Immunol 2007 37 3 1407 1413 实验分组 n 20 PBS组 空白对照 ATO组 1 0 mol L ATO 5 AZA ATO组 1 0 mol L 5 AZA 1 0 mol L ATO 实验路线图 PBS组 CD4 T 细胞 IFN 和IL 4基因启动子
7、甲基化水平测定 C57BL 6J小鼠脾细胞MRL lpr小鼠脾细胞 ATO组5 AZA ATO组 DNA抽提 实验方法 CD4 T细胞的分离和培养 1 小鼠脾脏淋巴细胞 分离 密度梯度离心法 3 细胞活力检测 台 盼兰拒染法 2 CD4 T细胞分选 免疫磁珠法 4 CD4 T细胞培养 PHA p和IL 2常规 刺激 体外诱导48小时后 进行分组 实验方法 基因启动子甲基化水平测定 1 CD4 T细胞基因组DNA抽提 2 DNA亚硫酸氢盐修饰 3 PCR扩增IFN 和IL 4基因启动子 CpG岛中非甲基化C U T CpG岛中甲基化mC C C CpG岛以外序列中的C U T 4 DNA凝胶回收
8、 5 TA克隆构建克隆载体 6 抗性及蓝白斑筛选获得阳性克隆子 7 原位PCR鉴定 8 提取质粒 9 测序 pcr pcr pcr 统计学处理 特异CpG位点甲基化率 某单个CpG位点上测出 为甲基化的CpG个数 该CpG位点重复测序样本量 100 特异CpG位点甲基化率采用Fisher确切概率法 统计学处理 表示甲基化状态 表示非甲基化状态 Wenzhou Medical College 统计学处理 启动子平均甲基化率 该启动子甲基化的CpG 个数 所在启动子CpG总数 100 启动子平均甲基化率两个样本间采用独立样本t检 验 方差不齐时采用校正t检验 多组样本间比较 采用方差分析 方差不齐
9、时采用Dunnett s t3检验 P 0 05为差异有统计学意义 Wenzhou Medical College 统计学处理 第1个样本启动子甲基化率 1 8 100 12 5 实验结果 MRL lpr小鼠IFN 基因启动子测序图 PBS组 MRL lpr小鼠IFN 基因启动子测序图 ATO组 MRL lpr小鼠IFN 基因启动子测序图 5 AZA ATO组 IFN 基因启动子序列测定结果 MRL vs C57 表示甲基化状态 表示非甲基化状态 IFN 基因启动子序列测定结果 组内比较 表示甲基化状态 表示非甲基化状态 IL 4基因启动子序列测定结果 MRL vs C57 表示甲基化状态 表
10、示非甲基化状态 IL 4基因启动子序列测定结果 组内比较 表示甲基化状态 表示非甲基化状态 基因启动子平均甲基率 n 20 x s PBS组 IFN 启动子甲基化率 MRL vs C57 PBS组MRL lpr狼疮小鼠IFN 启动子区平均甲基化率 8 1 12 4 显著低于C57BL 6J小鼠 63 1 23 5 P 0 05 PBS组 IL 4启动子甲基化率 MRL vs C57 PBS组MRL lpr狼疮小鼠IL 4启动子区平均甲基化率 14 0 14 7 显著低于C57BL 6J小鼠 55 0 18 2 P0 05 ATO组 IL 4启动子甲基化率 MRL vs C57 ATO组MRL
11、lpr狼疮小鼠IL 4启动子区平均甲基化率 52 0 28 6 与 C57BL 6J小鼠 59 0 17 7 之间无显著性差异 P 0 05 5 AZA ATO组 IFN 启动子甲基化率 MRL vs C57 5 AZA ATO组MRL lpr狼疮小鼠IFN 启动子区平均甲基化率 50 0 29 2 与C57BL 6J小鼠 51 9 22 3 之间无显著性差异 P 0 05 5 AZA ATO组 IL 4启动子甲基化率 MRL vs C57 5 AZA ATO组MRL lpr狼疮小鼠IL 4启动子区平均甲基化率 51 0 22 0 与C57BL 6J小鼠 60 0 24 3 之间无显著性差异
12、P 0 05 PBS组 8 1 12 4 ATO 组 46 9 31 6 ATO 5 AZA组 50 0 29 2 MRL lpr小鼠组内IFN 基因启动子甲基化率 PBSATO5 AZA ATO MRL lpr小鼠组内IL 4基因启动子甲基化率 PBS组 14 0 14 7 ATO 组 52 0 28 6 ATO 5 AZA组 51 0 22 0 PBSATO 5 AZA ATO C57BL 6J小鼠组内IFN 基因启动子甲基化率 PBS组 63 1 23 5 ATO 组 51 9 20 0 ATO 5 AZA组 51 9 22 3 PBS ATO 5 AZA ATO C57BL 6J小鼠组
13、内IL 4基因启动子甲基化率 PBS组 55 0 18 2 ATO 组 59 0 17 7 ATO 5 AZA组 60 0 24 3 PBS ATO 5 AZA ATO 讨论 讨论一 国内外报道 MRL lpr狼疮小鼠发病期DNA甲基化水 平明显下降 本实验发现 发病期MRL lpr狼疮小鼠PBS组Th细胞 因子IFN 和IL 4基因启动子呈现低甲基化水平 而 正常对照C57BL 6J小鼠PBS组则表现为高甲基化水平 Santiago Raber ML Laporte C Reininger L et al Genetic basis of murine lupus J Autoimmun R
14、ev 2004 3 1 33 39 Mizugaki M Yamaguchi T Ishiwata S et al Alteration of DNA methylation levels in MRL lupus mice J Clin Exp Immunol 1997 110 2 265 269 Sawalha AH Jeffries M Defective DNA methylation and CD70 overexpression in CD4 T cells in MRL lpr lupus prone mice J Eur J Immunol 2007 37 3 1407 141
15、3 讨论一 本科题组既往体内外实验证实 发病期MRL lpr狼疮小 鼠Th细胞因子IFN 和IL 4表达明显高于C57BL 6J正 常对照小鼠 但机制未明 上述结果结合本实验提示 SLE发病相关的两个关键细 胞因子IFN 和IL 4转录表达的调控可能通过染色质水 平启动子的甲基化进行 其启动子低甲基化可能是导 致IFN 和IL 4基因转录表达量增加的机制之一 讨论二 本课题组已证实 ATO能够逆转MRL lpr狼疮小鼠Th 细胞活化状态下IFN 和IL 4分泌和转录水平的异常高 表达 但机制尚未明 本实验证实 ATO提高MRL lpr狼疮小鼠Th细胞IFN 和IL 4基因启动子甲基化水平 推测
16、 ATO可能通过提高MRL lpr狼疮小鼠Th细胞 IFN 和IL 4基因启动子的甲基化水平 或者作为其中 的机制之一 来抑制其基因的表达 讨论三 本课题组已证实 ATO对C57BL 6J小鼠Th细胞IFN 和IL 4 分泌和转录水平的无明显影响 具有良好的安全性 但机制 未明 本实验证实 ATO对C57BL 6J小鼠Th细胞IFN 和IL 4基因 启动子甲基化水平无显著影响 推测 ATO对免疫正常 即非活化状态下的Th细胞因子IFN 和IL 4基因启动子甲基化无影响 而只对异常增生活跃的狼 疮小鼠Th细胞因子IFN 和IL 4基因启动子甲基化有促进作 用 进一步证实其选择性甲基化促进作用和免疫抑制调节功 能 说明了该浓度药物和作用时间的安全性 讨论四 本课题组体内实验发现 5 AZA能降低MRL lpr狼疮 小鼠脾脏 淋巴结及血液的DNA总体甲基化水平 提 高血清中抗dsDNA抗体水平 本课题体外实验发现 5 AZA能增加MRL lpr狼疮小 鼠和C57BL 6J小鼠Th细胞IFN 和IL 4的分泌及其 mRNA水平 ATO处理经5 AZA预处理的上述细胞后 上述因子的分泌和mRNA
