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1、1离体肝脏灌注保存的实验研究【摘要】 目的：通过建立体外肝灌流模型的试验，研究肝灌流法在肝保存中所起的作用. 方法：自普通健康的杂种犬获取供肝，采取同时灌流门静脉和肝动脉，共同氧合灌流液的方法对离体肝脏进行灌注试验. 结果：随灌注时间延长,灌注肝脏的生理和生化功能损伤. 至肝脏灌流 24 h，灌流液 PO2 为（387.22.3 ）mmHg ，HCO3为（3.60.1 ）mmol/L， AST 为（130028） nkat/L， ALT 为（186725） nkat/L， TBIL 为（12.60.3） mmol/L. 在灌流2436 h，体外肝脏均出现程度不同的暗红色淤斑，胆汁生成量减少，灌
2、注压也迅速上升. 结论：完成了大动物肝脏离体灌注，证明本肝灌流系统在 24 h 内可基本维持肝脏的生理和生化功能 . 【关键词】 人工肝 离体肝 灌注 保存 生物学 0 引言 肝移植目前是治疗终末期肝病的有效手段 ,术后发生原发性移植肝无功能及移植肝原发性功能紊乱都与移植肝冷保存后的再灌注损伤相关. 目前该领域研究中使用持续循环灌流法，以生物人工肝为主，附加血或血浆灌流组成的体外组合型人工肝辅助装置，成为研究最多的人工肝系统. 1 材料和方法 1.1 材料 BM25 血液透析泵（美国 Baxter 公司） ；90 型鼓泡式氧合2器（西安西京医疗用品有限公司） ；2 孔水浴锅（北京科伟永兴公司）
3、；狗血浆(第四军医大学实验动物中心制备)；人造血红蛋白（上海凯正公司惠赠） ；KB 液 (第四军医大学西京医院药剂科) ；普通健康的杂种犬 12 只（第四军医大学实验动物中心提供） . 1.2 方法 1.2.1 离体肝获取普通健康的杂种犬 12 只，质量约(72) kg，雌雄不限，犬龄 12 岁. 术前 12 h 禁食，自由饮水,并一直在本校实验动物中心实验室进行饲养及实验研究. 依次将 12 只杂种犬全麻后取腹部正中切口，逐层解剖止血，分别依次游离胆总管、门静脉和肝动脉. 向肝动脉、门静脉近肝端分别插入管径合适的灌流管，并注入含利多卡因肝素生量盐水约 1000 mL 后快速切下肝脏，置入空盆
4、中称重后置入 4 生理盐水中保存 2030 min，同时行肝动脉、门静脉插管及胆囊置管引流，并记录热缺血时间. 1.2.2 离体肝脏的灌注 肝脏体外灌流循环的连接（图 1）灌流液由肝动脉、门静脉流入，经肝脏，从下腔静脉流出，流入至鼓泡式氧合器，由血液透析泵控制流量，再从中流出分成两路流入灌流肝. 肝动脉、门静脉入路加以氧合器氧合；两路都加以压力监测；同时再给温度监测，保证灌流系统温度的调节. 肝脏体外灌流及监测指标. 经复温后将离体肝脏置于 37恒温水浴箱中行持续灌注，灌注流量按取肝前 B超测定为准. 记录体外肝脏的热缺血时间、灌流时间. 观察体外肝脏一般情况及病理变化. 此外，自灌注之时起每
5、 4 h 分别取入肝和出3肝灌注液，行血气分析、转氨酶（AST，ALT）等生化指标，并根据结果调节灌注液的理化数值，同时间断给予抗生素、营养液、保肝药、罂粟碱等药品对症处理. 统计学处理：数据用 xs 表示,SPSS 10.0 统计软件包处理. 2 结果 2.1 一般情况及病理学检查 在开始 ECLP 灌流后，体外肝脏可以看到有程度不同的灰白缺血样斑块，质地柔软. 在灌流 2436 h 左右时出现程度不同的暗红色淤班，胆汁生成量减少，在灌流 36 h 后肝脏灌注压迅速上升. 随灌流进行不同时间点取肝组织标本进行肝组织的 HE 染色，灌注后 2 h 肝细胞即出现糖原消耗现象，表现为细胞质淡染、空
6、泡状；8 h 肝细胞糖原消耗进一步加重，并偶见小灶状的肝细胞坏死；24 h肝细胞坏死灶逐渐增多，局部肝板断裂； 36 h 坏死灶明显增大，肝板广泛断裂；48 h 肝细胞广泛凝固性坏死，细胞核消失 . 2.2 肝脏灌流的各项数据灌流肝脏热缺血时间（16.752.50）min，灌流时间（48.03.60）h. 灌流肝脏各个时间点的胆汁分泌量、门静脉的压力及血气分析、肝功等生化指标数值均有变化（表 1）.表 1 肝脏灌流数据（略） 3 讨论 目前体外肝脏灌流（extracorporeal liver perfusion,ECLP）的研究主要集中于通过对其肝的支持作用，为急性肝衰竭（acute liv
7、er failure,ALF）和肝昏迷的患者渡过到肝移植4和自然恢复期提供了可能1. 如何使体外肝脏长时间存活并保持生理生化功能和组织结构完全性一直是研究的重点. Eeuhau 等2研究表明，将体外肝脏保存在 38的生理盐水中，并将入肝血流的温度也保持在 3839，对于体外肝脏的功能维持十分重要. 而 Brauer 等3 研究发现肝脏胆汁的分泌受温度影响较大，全血灌流肝脏在 4044条件下生成最多，随温度下降胆汁生成逐渐减少，25时停止. 根据前人经验及肝脏在体内的平常生理条件，我们选择将恒温水浴箱的温度控制在 37，将离体的肝脏置于接近体温的环境下使用血液灌流，借以提供其生存所需的丰富营养，
8、氧供更接近生理. 氧供是保持 ECPL 体外肝脏活性与的重要条件，目前普遍采用氧合器自然氧合的方法来满足肝脏的氧需要. 生理状态下门静脉的氧分压及肝脏缺血再灌注损伤后门静脉供氧过度会造成“氧爆发”产生更多的氧自由基从而加重损伤. 本实验将氧气灌氧流量控制在11.5 L/min,采用分时分次加入人造血红蛋白来氧合门静脉和肝动脉的灌流液的方式，具体过程中可以通过血气分析了解系统的 pH值、氧分压等变化，并做必要的供氧调整，以确保灌流液中的携氧量适中、有效. 在以往的研究中我们发现，在对门静脉单独灌流与肝动脉、门静脉同时灌流进行比较时，后者比前者灌流时间延长，肝脏存活时间延长4. 因此本试验亦采用同
9、时灌注肝动脉和门静脉的灌注方式，5同时将肝动脉灌注压控制在 1.33 kPa，门静脉灌注在 0.71.3 kPa，每克肝脏灌流量控制在 0.81.2 mL/min. 从本研究可以看出，在灌流的 024 h 内，灌流液的酸碱度基本上保持在中性，随着灌流时间的加长，酸碱度逐渐开始变酸，肝脏代谢乳酸开始增加. 氧分压呈下降趋势， CO2 分压逐渐升高，灌注液中转氨酶（AST，ALT）逐渐升高，胆红素含量升高，提示随着灌注时间的延长灌注肝脏的生理和生化功能有一定的损伤. 为了延长灌注肝脏的存活时间，我们曾使用 前列腺环素（prostacyclin，PGI2）及三磷酸腺苷 氯化镁（ATPMgCl2 ）进
10、行处理. 因为目前已证实，PGI2 能提高细胞内 cAMP，使血管舒张，并有对抗血栓素 B2 的作用，供肝经 PGI2 预处理后，可提高对缺血的耐受力及增加移植体存活率；而 ATPMgCl2 输入后能使肝细胞ATP 含量成倍增加. 肝细胞内氧自由基（oxygen free radical，OFR）过量产生及钙离子超载，是供肝低温保存 再灌注过程中组织细胞坏死性变化的两个基本病理机制5-6. 在本实验中，我们观察到肝脏在灌注一定时间后（8 h） ，会逐渐出现肿胀、灌注压力增高等表现，推测与上述理论有关. 我们认为，为了使离体再灌注的肝脏保持活力，就必须完全理解肝移植体保存的分子机制7 ，以优良的
11、保存液、灌注液和更加有效的保存方法为离体肝提供合适的理化环境和生化环境，从而6进一步完善整个体外灌流系统. 【参考文献】 1Pascher A, Saucer IM, Hammer C, et al. Extracorporeal liver perfusion as hepatic assist in acute liver failure: A review of world experience J. Xenotransplantation, 2002,9(5):309-324. 2Neuhaus P,Blumhardt G. Extracorporeal liver perfusion
12、: Applications of an improved model for experimental studies of the liverJ.Int J Artif Orgnns,1993,16(10):729-739. 3Brauer RW,Leong GF,Holloway RJ.Mechanic of bile secretion.Effect of perfusion Pressure temperature on bile flow and bile secretion pressureJ.Am J Physiol,1954,177:103-112. 4Mora N,Kapt
13、anoglu L, Zhang Z, et al.Single VS.Dual porcporeal extracorporeal liver perfusionJ.J Surg Res,2002,103(2):228-235. 5Koeppel TA, Lehmann TG, Thies JC, et al. Impact 7of Nacetylcysteine on the hepatic microcirculation after orthotopic liver transplantationJ . Transplantation,1996,61(9):1397-1402. 6Ste
14、fanovich P, Ezzell RM, Sheehan SJ, et al. Effects of hypothermia on the function, membrane integrity, and cytoskeletal structure of hepatocytesJ. Cryobiology,1995,32(4):389-403. 7Tredger JM. Ischaemiareperfusion injury of the liver: Treatment in theory and in practiceJ. Biofactors, 1998,8(12):161-164.
