《纯泰镍离子金属螯合亲和层析介质(Ni-NTA)使用说明书(完全版)[1]》由会员分享，可在线阅读，更多相关《纯泰镍离子金属螯合亲和层析介质(Ni-NTA)使用说明书(完全版)[1]（5页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、_ 地址：上海市浦东新区张江高科技园区蔡伦路 333 号 A505 室 邮编：201203 电邮： 电话：021-50797319 传真： 021-50797322 网址： 镍镍 离离 子子 金金 属属 螯螯 合合 亲亲 和和 层层 析析 介介 质质 使使 用用 说说 明明 书书 （ 完完 全全 版版 ） 一、 简介 金属螯合亲和层析，又称固定金属离子亲和色谱，其纯化原理是利用蛋白质表面的组氨酸与多种过渡金属离子如Cu2+， Zn2+， Ni2+， Co2+， Fe3+形成配位相互作用，从而能够吸附富含这类氨基酸的蛋白质，从而达到分离纯化的目的。因此，固定有这些金属离子的琼脂糖凝胶就能够选择
2、性地纯化这类含有多个组氨酸的蛋白以及多肽和核苷酸。半胱氨酸和色氨酸与固定金属离子结合力要远小于组氨酸残基，对纯化影响不大。 纯泰特殊结构设计的镍离子金属螯合亲和层析介质包括 Ni-NTA和 Ni-IDA两种配体，既具有特异性好、螯合镍更稳定，镍离子脱落少，使用寿命长的优势，同时具有基础层析介质颗粒粒度均匀，流速快的优点，并且物理和化学稳定性好，能耐受更高浓度的还原剂、变性剂和去垢剂，批次重复性好，质量稳定。本产品已经螯合好镍离子，使用更方便。 注：镍离子有六个螯合价位，Ni-NTA 螯合了四价，剩余两价；而Ni-IDA 螯合三价，剩余三价。因此Ni-IDA Agarose结合作用力要比 Ni-
3、NTA Agarose强，在同样条件下Ni-IDA Agarose 的载量要比Ni-NTA Agarose高，而且洗脱杂质和目标蛋白所用的缓冲液中咪唑浓度更高；但Ni-NTA Agarose 更稳定，耐受更强的还原剂，镍离子更不易脱落。具体应用何种介质视个人习惯以及纯化条件而定。 二、 性能参数 特点 特殊NTA 、 IDA结构设计，蛋白载量大，专一性高，使用寿命长 基质 6%的交联琼脂糖凝胶 配体 NTA-Ni2+/IDA-Ni2+配体密度 2040mol /ml 吸附载量 30mg蛋白(60kda)/ml 介质平均粒径 100m 最大流速 600cm/h pH范围 310，在位清洗时pH
4、范围可到211 保存温度 +48 保存液体 20%乙醇 三、 适用范围 分离His融合蛋白及能被金属离子吸附的多肽、蛋白、核苷酸、磷酸化蛋白。 四、 E.coli表达可溶性 his重组蛋白纯化操作说明 1. 缓冲液配制 z 缓冲液A （平衡缓冲液）：10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，140mM NaCl，2.7mM KCl ，用高浓度NaOHl 调节pH 值至8.0。 z 缓冲液B （洗脱缓冲液）：50mM NaH2PO4，300mM NaCl，500mM imidazole （咪唑），用高浓度NaOHl 调节pH 值至 8.0。 z 缓冲液C （咪唑浓度稀释液）： 50mM
5、 NaH2PO4，300mM NaCl，用高浓度NaOH调节pH 值至8.0 。 注： 如使用试剂盒，盒中提供10 缓冲液 A、 1缓冲液B 和10 缓冲液 C的配制干粉。分别在缓冲液A 和C的盛装容器中加入双蒸水定容至100ml ，得到缓冲液A 和C 的10 倍浓缩液，使用时根据需要取一定量进行 10倍稀释，即得到上述正常使用浓度的两种溶液。缓冲液 B的每包配制干粉可配制1 缓冲液B 500ml，配制时将一包干粉先溶于适量双蒸水中，最后定容至500ml 。每种缓冲液均应在稀释成正常使用浓度以后，再调节pH 值。 z 缓冲液D （咪唑梯度洗脱液）：用缓冲液B 和缓冲液C 按不同比例配制，配制比
6、例如下（100ml总体积）： 咪唑浓度 缓冲液C(ml) 缓冲液B(ml) 0mM 100 0 10 mM 98 2 20 mM 96 4 50 mM 90 10 60 mM 88 12 100 mM 80 20 150 mM 70 30 200 mM 60 40 250mM 50 50 400 mM 20 80 各种溶液配制完毕后，最好进行脱气处理，0.45m滤膜过滤备用。 2. 样品预处理： 按每克湿重菌体/45ml 缓冲液 A的比例充分悬-1- _ 地址：上海市浦东新区张江高科技园区蔡伦路 333 号 A505 室 浮离心收集的菌体， 400w功率下，每个循环超声3s ，冷却2s ，共循
7、环180次破碎菌体； 4、 13000rpm离心 15m，收集上清液或用0.45 m滤膜过滤，并用高浓度NaOH调节 pH至8.0待上样。 3. 装柱： z 聚苯乙烯层析柱 1) 将层析柱固定在铁架台或层析架上，封闭层析柱下端出口，向柱内充入纯水，排开层析柱内空气，先将垫片完全浸没于水面下方，在保持水平的状态下，小心推向底部，避免垫片下方滞留气泡。 2) 打开层析柱下端出口，排出柱中纯水；在液面低至距垫片11.5cm 高度时封闭下端出口，用移液枪按需要量吸取介质，或用玻璃棒紧靠柱子内壁引流，将介质加入到层析柱中；静置30min，让介质自然沉降。 3) 从上端管口将另一垫片缓慢推至介质沉降平面，
8、使介质表面保持水平状态，注意避免垫片与介质接触面滞留气泡（如对实验要求并非十分严格，为提高流速，可不覆盖上垫片）。 4) 在使用一段时间后，如果层析柱流速减慢，可先用小镊子沿边缘将垫片推翻，夹出垫片，倒出介质，清洗或更换新的垫片后，按2 ）、 3）所述步骤重新装柱；或不更换垫片，用细棒搅拌介质，使其疏松，再装入上端垫片。 z 玻璃层析柱 1) 将层析柱洗净后垂直固定到铁架台上；向柱中加入蒸馏水，排开柱子中的空气，在蒸馏水排尽以前，关闭柱子出口，在柱内保留58cm 高度的蒸馏水。 2) 先将介质混匀，用移液枪按需要量吸取介质，或用玻璃棒紧靠柱子内壁引流，将介质加入到层析柱中；静置30min，让介
9、质自然沉降。 3) 从上端管口将转换杆出液端缓慢推至介质沉降平面，使介质表面保持水平状态，注意避免转换杆与介质接触面间滞留气泡。 4) 在使用一段时间后，如果流速减慢，可先卸下上转换杆，将介质倒出，再取出下转换接头中滤网，清洗或更换后重新装柱。 4. 过柱： 1) 用510倍介质体积的缓冲液A 平衡亲和柱； 2) 上样； 3) 用 510倍介质体积缓冲液A 洗去层析柱中未结合蛋白； 4) 用缓冲液B 和缓冲液C 配制的不同浓度缓冲液 D洗脱； 9 最高纯度洗脱方案：用含0 、 60、 100、 150、200、 250mM 咪唑的缓冲液D 分步洗脱，每个梯度23倍介质体积洗脱； 9 最高收率洗
10、脱方案：先用510 倍介质体积含20mM 咪唑的缓冲液D 洗脱，再用510 倍介质体积含250mM 咪唑的缓冲液D 洗脱。 注：纯化过程流速不宜过快，对于1ml 介质，流速保持在0.5ml/min 为宜。 5. 介质清洗与再生： 如果使用一段时间以后，介质上有杂质沉积导致介质颜色改变和蛋白结合能力下降，需对介质进行清洗或再生。 z 介质清洗： 1) 用10倍介质体积 0.5M NaOH过柱，适当调整流速，或洗脱至10倍介质体积时停30min后继续洗脱，保证介质与NaOH 溶液接触时间达到30min以上。 2) 用 10倍介质体积去离子水洗去层析柱中的碱液。 3) 用10倍介质体积缓冲液A 平衡
11、层析柱。 z 介质再生： 1) 用25倍介质体积脱镍缓冲液（50mM Na3PO4，300mM NaCl，100mM EDTA ，pH 8.0 ）过柱； 2) 用 5-10倍介质体积 0.5M NaOH过柱，适当调整流速，如流速较快，则洗脱至10 倍介质体积时停30min后继续洗脱，保证介质与NaOH 溶液接触时间达到30min 以上； 3) 用10倍介质体积去离子水洗柱； 4) 用3 倍介质体积10mM Na3PO4， 1M NaCl， pH 7.4缓冲液平衡层析柱； 5) 用3 倍介质体积20mM NiCl2或NiSO4(溶于去离子水) 过柱； 6) 用3 倍介质体积10mM Na3PO4
12、， 1M NaCl， pH 7.4缓冲液洗柱； 7) 用5 倍介质体积缓冲液A 平衡层析柱。 6. 介质保存 48条件下，介质可长期保存于 20%乙醇中。 7. SDS-PAGE检测： 1) 不同浓度SDS-PAGE 分离胶分离范围 邮编：201203 电邮： 电话：021-50797319 传真： 021-50797322 网址： -2- _ 地址：上海市浦东新区张江高科技园区蔡伦路 333 号 A505 室 邮编：201203 电邮： 电话：021-50797319 传真： 021-50797322 网址： 1.低分 子 量 Marker；2.上样液； 3.纯泰NTA-流穿液； 4.纯
13、泰NTA-洗脱液； 5.对照-流穿液； 6.对照-洗脱液 2) SDS-PAGE操作流程 A. 每个胶孔最适蛋白上样量为510 g。 B. 将含510 g蛋白的样品溶液与loading buffer 混匀， 90孵育 5min，取出后5000rpm 离心 1 min。 C. 上样， 15mA/30mA恒流或 80V/120V恒压电泳。 五、 E.coli表达 His重组蛋白包涵体纯化操作说明 1. 缓冲液配制： z 缓冲液E： 8 M Urea， 100 mM NaH2PO4， 100 mM TrisCl，用高浓度NaOH调节pH 至 8.0。 z 缓冲液F ： 8 M Urea， 100 m
14、M NaH2PO4， 100 mM TrisCl，用高浓度HCl 调节pH 至6.3 。 z 缓冲液G ： 8 M Urea， 100 mM NaH2PO4， 100 mM TrisCl，用高浓度HCl 调节pH 至4.5 。 各种溶液配制完毕后，最好进行脱气处理， 0.45 m滤膜过滤备用。 注： 也可按照可溶性蛋白的缓冲液配制与操作方式进行，只需在缓冲液中加入8M 脲或 6M盐酸胍。 2. 样品处理： 1) 冰上融化冻存菌体，待其完全融化后按每克湿重菌体/5ml 缓冲液 E的比例充分悬浮菌体。 2) 室温条件下振摇菌体15 60min，通过温和涡旋振荡或超声处理裂解菌体，注意避免产生泡沫。
15、溶液变得透明表明裂解完全。 3) 4、13000rpm 离心15min ，收集上清液或用0.45m滤膜过滤，并用高浓度NaOH 调节 pH 至8.0待上样。 3. 操作步骤： 1) 用10倍介质体积缓冲液E平衡亲和柱； 2) 上样； 3) 用10倍介质体积缓冲液E过柱，重新平衡介质； 4) 用 10倍柱体积缓冲液 F过柱，洗去未结合的杂蛋白； 5) 用510倍柱体积缓冲液G 洗脱，收集洗脱液。 6) 用10倍柱体积缓冲液A 重新平衡介质。 注：纯化过程流速不宜过快，对于1ml 介质，流速保持在0.5 ml/min为宜。 六、 实验实例 1. Ni-NTA Agarose 纯化 His-tag 蛋白 z 层析介质：纯泰NTA 1ml；对照介质（国际领先品牌）1ml z 样品：表达可溶性 His-tag 融合 thioredoxin
