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1、1甲胎蛋白化学发光免疫定量分析方法的建立作者：冯艳铭马俊芬吴飚郭兰英吴拥军李智涛吴逸明 【摘要 】 目的： 建立检测甲胎蛋白化学发光免疫定量分析方法 . 方法： 采用双抗体异位点一步夹心法，以甲胎蛋白单克隆抗体作为固相包被，采用改良过碘酸钠法进行甲胎蛋白多克隆抗体与碱性磷酸酶偶联制备酶标抗体；以金刚烷胺衍生物 CSPD 作为底物，优化CSPD 与 SapphireII 发光体系；用国家标准品校定定量标准品，建立了人血清 AFP 的化学发光免疫定量分析法. 用该法检测 800 份正常人血清，确定正常值参考范围，将临床血清标本 100 份与 bayer Acs: 180全自动发光体系统进行比较.
2、结果： 本方法的最低检出量为 2.0 ng /mL，线性范围 2.0600.0 ng/mL,批内和批间的变异率分别为 6.7%和 7.7%，回收率在 98.2%102.5%之间. 与 CEA(3 g/mL)的交叉0.15%；与铁蛋白(10 g /mL) 0.04%；与人血清白蛋白（200 g/L）2.510-8，与人血清丙球蛋白（100 g/L）2.010-8，与 bayer Acs:180比较相关系数r=0.994（ P0.001）. 结论： 建立的甲胎蛋白化学发光免疫分析法可常规用于临床检测. 【关键词】 甲胎蛋白类；化学发光测定法；定量分析 【Abstract】 AIM: To esta
3、blish a method of chemiluminescent immunoassay for determination of alpha 2fetoprotein(AFP) in human serum. METHODS: The twosite enzyme immunoassay is based on the direct sandwich technique. A monoclonal antibody was bonded to the microplate for coating and the conjugation of alkaline phosphatase to
4、 another polyclonal antibody was performed by NaIO4 method. Chemiluminescent immunoassay was established by optimizing CSPD and SapphireII luminescent system. Sensitivity, linear scope, precision, interference and recovery for the method were evaluated. The reference range was defined by testing 800
5、 serum samples from healthy subjects.The comparison for 100 serum samples from patients was assayed by the bayer Acs:180 Automated Immunoassay system. RESULTS: The detectable minimum was 2.0 ng/mL. The linear scope was from 2.0 to 600.0 ng/mL. Average inter and intraassay were 7.7% and 6.7%, respect
6、ively. The recoveries ranged from 98.2% to 102.5%. The crossreacting rate for CEA(3 g/mL), Ferritin(10 g /ml), HAS(200 g/L), IgG(100 g/L) were0.15%, 0.04%, 2.510-8 and 2.010-8, respectively. Compared with bayer Acs:180 Automated immunoassay system, the relative coefficient was 0.994（P1128 的羊，进行心脏采血，
7、分离血清，羊抗 AFP 血清按照 1.3.1 方法进行纯化. 1.2.3 碱性磷酸酶标记抗体的制备采用改良过碘酸钠 乙二醇法进行标记1 ，将获得的 IgGALP 用含 100 g/L 小牛血清的0.05 mol/L (pH 7.6)TBS 缓冲液按 11000 稀释成工作液，保存于-20. 1.2.4AFP 校准品制备用系列国家标准品标定 AFP 纯品抗原后，用 AFP 校准品稀释液稀释成含量分别为 0, 10, 25, 50, 15, 600 ng/mL 系列浓度，用国家标准品做定量曲线进行校准品浓度测定、相关性分析,建立定量标准品. 1.2.5 化学发光系统的优化2-3由 Sapphire
8、II 不同浓度的5增强剂和 CSPD 组成底物工作液，进行化学发光值（RLU）测定，进行底物工作液的优化. 1.2.6 固相化抗体微孔板的制备4将抗 AFP 单抗用 0.05 mol/L 碳酸盐缓冲液(pH 9.6)稀释成 1.0, 2.0, 5.0, 7.0, 10.0, 15.0 g/mL 的包被浓度，按 100 L/孔的量加入包被板中， 37 包被 2 h，再用含 10 g/L 酪蛋白的 0.01 mol/L PBS (pH 7.4)37 封闭 2 h 后晾干备用，确定包被选择最佳包被抗体工作浓度. 1.2.7 正常人参考血清的确定用优化好的 AFP 化学发光定量试剂对 800 份健康人
9、标本进行浓度测定，进行统计学分析，计算x+2 S，确定正常血清参考范围. 1.2.8 化学发光免疫检测样品或标准品于相应孔分别加 25 L后，每孔再各加抗 AFPALP75 L，在震荡器上混匀 1 min，置37恒温反应 60 min. 洗掉游离成分，加入底物工作液 50 L，ALP 催化底物脱磷酸酯, 并发出 463 nm 的可见光，第 10 min后测定各加样品孔的发光值 RLU，并将数据用化学发光检测仪定量软件 Luminoskan Ascent version 2.4.1 软件进行定量分析. 2 结果 2.1 底物工作液的优化 CSPD 浓度为 0.8, 0.4, 0.2, 0.1 m
10、mol/L，SapphireII 浓度为 2.0, 1.0, 0.5, 0.25 g/L，分别用碱性磷酸酶 11000, 110000 在 5, 10 min 进行化学发光测定，记录不同增强剂和 CSPD 浓度的发光值，分别做出 CSPD 浓度RLU 的6曲线和 SapphireIIRLU 的曲线（图 1）. 分析上述数据可得出以下结论 CSPD 在 0.4 mmol/L 以下时，RLU 随 CSPD 浓度的变化而成比例变化，在 0.4 mmol/L 时达到平台，可能是底物浓度在 0.4 mmol/L 时使酶达到饱和. 增强剂SapphireII 浓度对 RLU 的变化较复杂，在 0.51 g
11、/L 时达到最大RLU，以后随着增强剂浓度的增加 RLU 反而下降. 确定底物工作液配制的浓度为：0.4 mmol/L 的 CSPD，增强剂 SapphireII 浓度为1.0 g/L. 2.2 包被抗体浓度和酶标记抗体浓度的确定根据不同包被抗体浓度测定定量标准品的发光值，分别做出不同浓度包被抗体RLU的曲线（图 2）. 包被浓度低时试剂的整体发光值也低，随着包被浓度的升高发光值也相应升高，在 5.0 g/mL 时，发光值达到一个平台期（此时灵敏度达到一个平台期） ，选择标准曲线接近于直线时的包被浓度（5 g/mL）为最佳. 2.3 最低检出量平行测定 20 孔零值校准品血清，计算零值校准品
12、RLU 平均值（x）及标准差 (S)，以 x+2 S 为测定值代入标准曲线方程中，求出其对应的浓度值，所对应的浓度值即为最低检出量为 2.0 ng/mL. 2.4 特异性检测分别测定与 CEA(3 g /mL)、铁蛋白(10 g /mL)、人血清蛋白(200 g/L)、人丙种球蛋白(200 g/L)的交叉反应7率，分别为0.15%, 0.04%, 2.510-8, 1.0310-8. 2.5 精密度测定 AFP 浓度为 48.873.2 ng/mL 的质控血清，重复检测 3 次,每次重复 20 孔，进行精密度测定，计算批内、批间平均变异系数分别为 6.7%, 7.7%. 2.6 正常人参考血清的确定对 800 份健康人血清检测进行统计，其中有 95.4%的小于 8.0 ng/mL,正常浓度只有上限而无下限，上限浓度去除 5%的不可信区间，同时参考放免检测结果和目前公认的正常值范围，本检测方法的正常人血清应小于 25 ng/mL. 2.7 准确度取 3 份临床样本分别加入 5
