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1、1热休克蛋白在内源性抗原提呈过程中的研究进展【摘要】 热休克蛋白(HSPs)参与经典内源性抗原提呈过程：(1) 胞质中 HSP70 具有抗原肽结合能力和 ATP 酶活性，能与 TAP 结合介导初步修饰的抗原肽进入内质网；(2)内质网腔中的 gp96 具有抗原肽结合能力和氨基肽酶活性，能与进入内质网中的抗原肽结合并对其再次进行修饰，使之能与 MHC-I 类分子结合。HSPs 可介导肿瘤抗原交叉提呈：HSPs-肿瘤抗原肽复合物作为外源性抗原，可通过APC 表面 CD91 分子介导的交叉提呈途径，激活特异性 CD8+CTLs,产生细胞免疫应答效应。【关键词】 热休克蛋白；抗原提呈；CD91 热休克蛋
2、白（heat shock proteins, HSPs）作为胞内含量丰富的可溶性蛋白，分为多个家族，其中胞浆中的 HSP70 和位于内质网的 HSP90 家族成员 gp96 是重要的多肽结合蛋白。他们能与细胞内抗原肽结合，参与内源性抗原的加工和提呈。本文以肿瘤抗原为例，探讨 HSPs 在内源性抗原提呈过程中的作用。1 HSPs 在经典内源性抗原加工、提呈过程中的作用2Malkovaky1 从整体水平上探讨了 HSP70 对肿瘤抗原加工提呈的影响。他们发现：人 B16 黑色素瘤细胞系低表达 MHC-I 类分子，该肿瘤细胞对内源性抗原肽的提呈能力微弱，不能有效激活特异性 CD8+细胞毒性 T 淋巴
3、细胞（cytotoxic T lymphocytes,CTLs） 。据此，他们用 HSP70 基因转染人 B16 黑色素瘤细胞系，使之稳定过量表达 HSP70。结果发现，此种 B16 黑色素细胞瘤表面肿瘤抗原肽-MHC-I 类分子复合物表达显著增高，能有效激活特异性 CD8+CTLs。在上述工作基础上，他们分别用稳定高效表达 HSP70 的 B16 黑色素瘤细胞和未转染 HSP70 基因的B16 黑色素瘤细胞接种小鼠，然后观察两组小鼠肿瘤生长情况。结果发现：接种稳定高效表达 HSP70 的 B16 黑色素瘤细胞的小鼠成瘤能力差，其肿瘤数量和大小均显著低于接种未转染 HSP70 基因的B16 黑
4、色素瘤细胞的小鼠。上述体内外试验结果表明，HSP70 参与经典内源性（肿瘤）抗原的加工和提呈。转染 HSP70 基因的人B16 黑色素瘤细胞，因其表面肿瘤抗原肽-MHC-I 类分子复合物表达显著升高，而能有效激活特异性 CD8+CTLs，发挥细胞免疫效应。Chen2等对胞浆中的 HSP70 参加内源性抗原肽加工、提呈的具体环节进行了研究。他们获得纯化的 HSP70 和含有内质网膜的细胞膜悬液,然后取纯化的 HSP70 或 BSA 分别与 125I 标记的抗原肽预孵育，使 HSP70 与 125I 标记的抗原肽结合。随后分别在两组中3加入等量的细胞膜悬液，4 作用 30min，离心取沉淀物，用
5、计数器，检测放射性元素 cpm 数值。结果发现，与 HSP70 和 125标记的抗原肽共育的细胞膜悬液沉淀物（HSP70 组） ，其 125放射性元素含量明显高于与 BSA、125I 标记的抗原肽共育的细胞膜悬液沉淀物（BSA 组） 。上述结果表明： HSP 能与细胞膜（含内质网膜）相结合。取上述细胞膜悬液沉淀物，用去垢剂处理使细胞膜破碎，加入抗 TAP 单克隆抗体，离心沉淀不溶性免疫复合物，得到与TAP 抗体相结合的成分。经 SDS-PAGE 电泳，HSP70 组 TAP 单抗沉淀物裂解液在凝胶中出现一条分子量为 70kD 的条带，BSA 组未见分子量为 70kD 的条带。鉴于 TAP 仅存
6、在于细胞内质网膜上，上述结果表明：HSP70-抗原肽复合物是通过其中的 HSP70 与内质网膜上的 TAP 结合的。 Anotoine3 等证实 gp96 具有氨基肽酶活性，能对进入内质网的抗原肽氨基末端进行正确修剪，使其最终适宜与 MHC-类分子结合。如：gp96 对疱状口炎病毒（vesicular stomatitis virus ，VSV）表位前体抗原肽（VSV19：含 19 个氨基酸）N 末端进行剪切，变为含 8 个氨基酸的供 CD8+CTLs 识别的抗原表位（VSV8） 。内源性抗原加工提呈过程归纳如下：（1）内源性抗原在胞质中首先与泛素结合形成泛素化抗原。此种泛素化抗原能够伸展为线
7、状，从而进入蛋白酶体；（2）泛素化抗原经蛋白酶体作用后，其羧基末端的氨基酸被降解，形成初步修饰的抗原肽4 ；（3）胞质中 HSP70 具有抗原肽结合能力和 ATP 酶活性，他们能与初步修饰的抗原肽结合形成 HSP70-抗原肽复合物；（4）此种复合4物能与位于内质网膜上的 TAP 结合并使之活化，产生 ATP 依赖的转运，使抗原肽与 HSP70 解离，进入内质网腔；（ 5）内质网腔中的 gp96 具有抗原肽结合能力和氨基肽酶活性，能与转运到内质网中的抗原肽结合，并对其再次进行修饰，使之成为能与 MHC-I 类分子结合的抗原肽。 （6）此种经过再次修饰的抗原肽在内质网中与MHC-I 类分子结合，形
8、成抗原肽-MHC-I 类分子复合体，进而以分泌囊泡形式，经高尔基体糖基化修饰后进入胞浆，通过胞吐作用表达于 APC 表面，供 CD8+CTLs 识别，启动特异性细胞免疫应答。内源性肿瘤抗原可通过上述经典 MHC-I 类分子途径激活特异性CD8+CTLs，发挥特异性细胞杀伤效应。但是研究发现，很多肿瘤细胞表面 MHC-I 类分子表达水平低下，或共刺激分子表达缺失。他们不能通过上述经典 MHC-I 类途径激活 CD8+CTLs。为此，学者们对肿瘤内源性抗原能否通过抗原交叉提呈作用激活肿瘤特异性CD8+CTLs 进行了研究探讨。2 HSPs 在内源性肿瘤抗原交叉提呈中的作用为探讨肿瘤内源性抗原诱导机
9、体产生特异性 CD8+CTLs 免疫应答的其他作用方式，Srivastava 5，6 等人做了如下试验：（1 ）他们用 HSPs 亲和层析柱，从甲基胆蒽（ Meth-A）诱导的小鼠肉瘤5组织细胞和同品系正常小鼠相同组织细胞中，分离得到 HSP90 家族成员 gp96-抗原肽复合物；（2 ）用三氯乙酸分别处理从上述两组小鼠中提取的 gp96-抗原肽复合物，使 gp96 与抗原肽分离，通过超滤离心获得 gp96 与抗原肽；（ 3）取 gp96-抗原肽复合物、纯化 gp96 和纯化抗原肽分别免疫正常 Balb/c 小鼠，2 周后给上述各组小鼠注射等量肉瘤细胞，观察小鼠体内肉瘤生长状况。结果发现：（1
10、）用小鼠肉瘤组织细胞中提取的 gp96-抗原肽免疫的小鼠，可产生抗肿瘤免疫应答，未见肉瘤生长；（2）用正常小鼠组织细胞中提取的 gp96-抗原肽复合物免疫的小鼠，不能产生抗肿瘤免疫应答，可见肉瘤生长；（3）用两组小鼠纯化抗原肽或纯化 gp96 分别免疫的小鼠，均不产生抗肿瘤免疫应答，可见肉瘤生长。此外，体外试验发现：抗原提呈细胞（antigen presenting cell,APC）与肉瘤中提取的 gp96-抗原肽复合物作用后，再与肉瘤小鼠 CD8+CTLs 共育，可使 APC 发生裂解破坏。述试验结果表明：（1）肿瘤内源性抗原肽或 gp96 本身作为外源性抗原被 APC 摄取加工处理后，不
11、能诱导机体产生特异性 CD8+CTLs 免疫应答；（ 2）gp96- 内源性抗原肽复合物作为外源性抗原被 APC 摄取加工处理后，可诱导机体产生特异性 CD8+CTLs 免疫应答。提示：肿瘤细胞生长过程中裂解释放的HSP-肿瘤内源性抗原肽复合物是诱导机体产生肿瘤特异性细胞免疫应答的物质。他们作为外源性抗原被 APC 摄取后，可通过交叉提呈作用，以肿瘤抗原肽-MHC-类分子复合物的形式表达于 APC 表面，供 CD8+CTLs 识别，从而启动特异性细胞免疫应答。63 APC 表面 CD91 介导的抗原内吞可导致抗原交叉提呈Binder 7发现， APC 表面 CD91 分子是能与 HSPs 特异
12、性结合的受体。他们用荧光素标记的 gp96 与巨噬细胞来源的RAW264.7 细胞株（APC）相互作用后，在荧光显微镜下可见细胞表面有荧光着色；加入非标记 gp96 可见荧光着色减弱，出现竞争抑制作用；用抗 CD91 单克隆抗体，可阻断荧光素标记的 gp96 对RAW264.7 细胞株的结合。上述实验结果证实： APC 表面的 CD91是能与热休克蛋白 gp96 结合的受体。在上述工作的基础上，他们应用类似的方法进一步证实 CD91 不仅是 gp96 的受体，也是HSP70、HSP90 和钙素的共同受体8 。进而 Binder9又用小干扰 RNA 转染 APC，使其表面 CD91 分子在短时间
13、内表达下调或缺失。然后在此时段内检测 APC 的抗原提呈能力，结果发现：APC对 HSP-抗原肽复合物的加工提呈能力显著下降，不能有效激活CD8+CTLs；当 APC 表面 CD91 表达恢复正常时，APC 对 HSP-抗原肽的加工提呈能力显著增强，可有效激活 CD8+CTLs。上述实验结果表明：APC 表面 CD91 介导的 HSP-抗原肽内吞，可通过抗原交叉提呈途径，使 MHC-类分子限制性 CD8+CTLs 活化，启动特异性细胞免疫应答。Arnold 10等进一步观察发现,gp96- 抗原肽在经 APC 表面 CD91 分子介导形成的酸性内体环境中，可被酶解产7生游离的 gp96 和抗原
14、肽。此种抗原肽可通过目前尚未知晓的作用方式穿越内体进入胞浆，然后通过经典内源性抗原提呈途径，以抗原肽- MHC-类分子复合物形式表达于 APC 表面，激活特异性CD8+CTLs，产生细胞免疫效应。4 结语肿瘤细胞作为非专职 APC,可通过经典 MHC-I 类途径，激活肿瘤特异性 CD8+CTLs，对肿瘤靶细胞产生特异性杀伤效应。最近研究发现，肿瘤细胞裂解释放的 HSPs-肿瘤抗原肽复合物作为外源性抗原，经 APC 面 CD91 分子介导摄入胞内后，可通过抗原交叉提呈途径激活肿瘤特异性 CD8+CTLs，发挥细胞免疫效应。上述研究成果深化了人们对机体抗肿瘤免疫机制的认识，也为 HSPs-肿瘤抗原
15、肽新型抗肿瘤疫苗的研制奠定了理论基础。【参考文献】1 Wells AD, Rai SK, Salvato MS, et al. HSP72-mediated 8augmentation of MHC class I surface expression and endogenous antigen presentation. Int Immunol, 1998, 10(5): 609-617. 2 Chen D, Androlewicz MJ. Heat shock protein 70 moderately enhances peptide binding and transport by
16、the transporter associated with antigen processing. Immunol Lett, 2001, 75(2): 143-148. 3 Menoret A, Niswonger ML, Altmeyer A, et al. An endoplasmic protein implicated in chaperoning peptides to MHC class I is an aminopeptidase. J Biol Chem, 2001,276(36): 33313-33318.4 Kloetzel,Peter-Michael. Proteasome and peptidase function in MHC-class-I-mediated antigen presentation. Curr Opin immunol,2004,16(1): 76-81.95 Srivastava PK. Inter
