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1、1热休克蛋白 70 与肝脏缺血预处理延迟保护效应作者：王占明鲁建国赖大年包国强马庆久吴金生 【关键词】 缺血预处理 关键词: 缺血预处理;热休克蛋白 70;缺血-再灌注损伤 摘 要: 目的 研究缺血预处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤后延迟保护效应的机制. 方法 建立大鼠肝脏缺血再灌注模型并进行缺血预处理，实验分组如下:假手术组（Sham-op-eration，S 组）;缺血再灌注组（ischemic reperfusion，I/R 组）;缺血预处理组（ischemic preconditioning，PC 组）;预处理加左旋硝基精氨酸组（preconditioning+L-NNA，PC+L 组）
2、，各组再灌注后检测血清谷丙转氨酶（alanine aminotrans-ferase，ALT ）及丙二醛（malondialdehyde，MDA ）含量、热休克蛋白 70（HSP70）免疫组化染色，肝组织石蜡切片 HE 染色及电镜观察. 结果 PC 组 ALT及 MDA 含量明显低于 I/R 组（P0.05） ，而在 648h 阶段则显著低于 I/R 组（P0.01 ）但仍高于 PC 组（P0.05 ）.HSP70 免疫组化染色:PC 组、PC+L组 348h 染色阳性率逐渐增多并显著高于 I/R 组（P0.01 ）. 结论 NO 和 HSP70 均对大鼠肝脏缺血再灌注损伤具有保护作用，HSP
3、70 可能是导致延迟保护效应的重要因素. 2Keywords:ischemic preconditioning;heat shock proteins;is-chemia-reperfusion injury Abstract:AIM To assess the protection of HSP70s and time course in the preconditioning（PC）in ischemia/reperfu-sion（I/R）injury in rat liver.METHODS 168SD rats were randomly divided into four group
4、s:S group:n=42，sham-operated control;I/R group:n=42，subjected to ischemia for70min;PC group:n=42，ischemia for5min and reperfusion for5min for twice，then subjected to is-chemia;PC+L group:n=42，the rats were administered L-NNA（10mgkg-1 ）before preconditioning，and then were subjected to ischemia for70m
5、in.Serum level of alanine aminotransferase（ALT）and malondialdehyde（MDA ）was detected during reperfution.Expression of HSP70in hepatic cell was analysed by histochemical technique.RESULTS Serum level of ALT and MDA of both I/R and PC+L group increased，compared with PC group（P0.05）but there was 3durin
6、g648h（P0.01）.The serum level of ALT and MDA was higher in PC+L vs PC group（P0.05）but lower than I/R group during648h（P0.01）.Expression level of HSP70in PC and PC+L group became gradually higher than I/R group during648h （P0.01）.CONCLUSION NO and HSP70might be involved in the protection against liver
7、 ischemia/reperfusion injury and HSP70might be associ-ated with the late preconditioning. 0 引言 自 1986 年 Murry 等1 首次提出缺血预处理以来关于预处理的机制研究不是很清楚，有很多学说，其中不少学者认为预处理保护效应包括早期保护效应和延迟保护效应2 ，但延迟保护效应的详细机制仍不清楚，为了进一步探讨其机制，本实验在大鼠肝脏缺血再灌注模型的基础上作缺血预处理，并利用 NO 合成抑制剂 L-NNA 消除早期预处理效应 3 ，通过检测血清 ALT，MDA含量变化及肝组织 HSP70 的免疫组化染
8、色，探讨延迟保护作用及机制. 1 材料和方法 41.1 材料 SD 大鼠，雌雄不拘，动物购自本校实验动物中心，ALT 试剂盒均购自北京北化精细化学品有限责任公司.MDA 试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司;热休克蛋白 70（HSP70 ）免疫组化染色系列 SABC 试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，编号 SA2077. 1.2 动物分组 SD 大鼠 168 只，体质量 180220g，随机分为 4 大组:假手术组（S 组，n=42） ，仅开腹、关腹，不阻断肝脏血流; 缺血再灌注组（I/R 组，n=42）: 肝门阻断 70min，持续再灌注; 预处理后缺血再灌注组（PC 组，n=42）:阻
9、断肝门，缺血5min 后再灌注 5min，共重复 2 次后阻断肝门，缺血 70min，持续再灌注; 预处理加 L-NNA 加缺血再灌注组（PC+L 组，n=42） ，预处理前在门静脉注射 L-NNA（10mgkg-1 ） ，然后与PC 组同法，标本采集:再灌注后于 0，1 ，3，6，12，24 和 48h 取静脉血清及缺血部位肝脏组织标本，乙醇、甲醛液固定，每个时间点均为 6 只大鼠，每只大鼠只限取一次标本后处死. 1.3 模型制备方法 依照 Kobayashi 法建立大鼠肝脏局部缺血再灌注模型，每只大鼠手术前禁食 12h，采用 2gL-1 戊巴比妥钠 30mgkg-1 腹腔内麻醉，正中剖腹，
10、分离肝十二指肠韧带，暴露肝门部.S 组不作进一步处理;所有缺血方法均为血管夹阻断门静脉进入肝脏第一次分叉以远，即阻断肝尾状叶及肝左叶血流，造成 70%肝脏缺血，阻断达到所需的时间后，松开血管5夹，进行再灌注. 1.4 指标检测 1.4.1 血清 ALT，MDA 的检测 下腔静脉血 2mL 常温1500rmin-1 离心 3min，取血清，用赖氏法测定 ALT活性. 比色法测定血清 MDA 含量. 1.4.2 肝组织热休克蛋白免疫组化染色 各时间点采集的肝脏组织标本均进行热休克蛋白 70（HSP70）免疫组化染色;采用生物免疫组织化学染色法，苏木素复染，高倍镜下，细胞质呈棕色着染者为 HSP70
11、 蛋白表达阳性细胞，观察切片中 10 个具有代表性的高倍视野，计算 1000 个肝细胞中（100 个细胞10 个高倍镜视野）染色阳性细胞数除以 1000 作为 HSP70 蛋白表达阳性率. 1.4.3 形态学检查 剪取肝左叶组织 1.5cm 见方的组织块，用甲醛液固定，制成石蜡切片，进行 HE 染色，镜下观察组织结构.另外各组 3，12 和 24h 组织块固定后送电镜观察 . 统计学处理: 全部数据以 x s 表示，均数间比较用 t 检验，采用 SAS 统计软件分析. 2 结果 62.1 各组大鼠再灌注后血清 ALT 及 MDA 变化 再灌注后各个时间点 I/R，PC，PC+L 组血清 ALT
12、，MDA 含量明显增高（P0.01vs S 组） ;PC 组明显低于 I/R 组（P0.05） ，648h 阶段则显著低于 I/R 组（P0.01） ，但仍高于 648h 阶段的 PC 组（P0.05，Tab1）. 表 1 再灌注后大鼠血清 ALT 及 MDA 变化略 2.2 免疫组化染色结果 各组染色结果见 Tab2:可见除 S 组外3h 后均有染色，但 I/R 组阳性率显著低于 PC 及 PC+L 组（P0.01） ，PC 组染色阳性率持续增高，48h 已达本实验的最高点，PC 组与 PC+L 组差异无统计学意义. 2.3 组织形态学改变 S 组大鼠肝脏外观光亮红润.PC 组肝脏与 S 组
13、基本相同.I/R 组肝脏呈深红色，并可见花白相间花斑状.HE染色切片:镜下可见 S 组肝细胞、枯否细胞及肝窦内皮细胞形态正常.I/R 组肝细胞核大小不一、有多级核分裂相及染色质边集，可见多数肝窦扩张，周围有大量红细胞淤积，肝窦及毛细血管内有微血栓形成. 随再灌注时间的延长，肝细胞肿胀、变性和坏死的程度和范围进行性加重，甚至在镜下难以看到完整的肝小叶结构.PC 组组织结构破坏轻微仅见部分肝细胞轻度浊肿、偶有变性、坏死及肝窦间隙少7量红细胞淤积，肝小叶结构基本完整;PC+L 组的 3h 组与 I/R 组的3h 组相近，损伤严重，PC+L 组的 12h 及 24h 亚组则与 PC 组接近. 电镜结果
14、显示，I/R 组核膜增厚，染色质边集，呈高电子密度，线粒体明显肿胀，嵴断裂、消失，基质呈高度毛玻璃状（Fig1A）;PC 组线粒体结构基本正常，但可见其肿胀，数量增多（Fig1B）;S 组核膜正常，线粒体分布均匀，大小正常（Fig1C）;PC+L 组则其 3h 组织结构与 I/R 组变化相近，12 及 24h 组则接近于 PC 组. 表 2 再灌注后肝脏细胞中 HSP70 的阳性表达率（略） 图 1 略 3 讨论 缺血预处理对肝脏具有确切的保护作用，这已为大量的事实所证实，本实验结果表明:对大鼠肝脏进行缺血预处理可以大幅度减低缺血再灌注损伤后 ALT 的释放，进一步证实预处理对肝实质细胞具有保
15、护作用，以往的实验大多集中在再灌注后 03h 进行各项指标检测，本实验结果显示在 648h 这一阶段预处理保护效应仍逐渐增强，提示了延迟保护效应存在的可能. 8文献报道 L-NNA 是一种 NO 合成抑制剂，一定浓度的 L-NNA可以阻断预处理保护效应3 ，本研究结果显示，预处理组应用NO 合成阻断剂 L-NNA 可以完全阻断再灌注后早期（03h ）的预处理保护效应，进一步证实了早期保护效应主要由 NO 所触发，这与国内外众多学者实验结果一致4 ，但其对 648h 所表现出来的保护效应不能完全阻断的事实进一步提示延迟预处理效应的存在及其机制的不同. 对于延迟保护的机制，Rizvi 等5 证实在兔心肌抑顿（myocardial stunning）延迟预处理中如果用环己氧胺抑制蛋白质合成则可以完全废除延迟预处理效应.Yellon 等6 认为与 PC诱导某些内源性保护物质的合成有关，如热休克蛋白、抗氧化酶类、特殊糖蛋白等，而热休克蛋白 70 是生物界普遍存在的一种内源性保护物质，缺血、缺氧、热应激7 等多种因素都可以引起它的高表达，其对动植物所表现出来的保护作用早已
