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1、1浸润性乳腺癌组织中 Ecadherin 和 CD44v6 表达及 DNA 倍体分析作者：马春梅 蒋敏 李敏 刘伟 朱艳芳 陈永林【摘要 】 目的： 探讨浸润性乳腺癌组织中Ecadherin（Ecad ）和 CD44v6 的表达及 DNA 倍体，并分析其临床病理学意义. 方法： 应用免疫组化 SP 法、组织化学 Feulgen染色及图像分析技术检测 103 例浸润性乳腺癌组织中 Ecad 和CD44v6 蛋白的表达及 DNA 倍体. 结果： 浸润性乳腺癌 Ecad 阳性表达率为 35.0(36/103)，Ecad 表达与组织学分级、组织浸润程度、腋窝淋巴结转移、复发、远处转移密切相关（P0.0
2、5）. CD44v6 阳性表达率为 76.7(78/103) ，其表达与组织学分级、组织浸润程度、肿瘤大小、腋窝淋巴结转移、复发、远处转移密切相关（P0.05）. Ecad 阴性和 CD44v6 阳性表达的浸润性乳腺癌多为异倍体癌；Ecad 阳性和 CD44v6 阴性表达的多为 2 倍体癌（P 0.05）. 结论： Ecad 的低表达与 CD44v6 的高表达可能参与乳腺癌的侵袭与转移；DNA 异倍体可作为对乳腺癌预后的判断指标之一. 【关键词】 乳腺肿瘤 E钙粘着糖蛋白 CD44v6 免疫组织化学 异倍体20 引言浸润和远处转移是导致乳腺癌临床治疗失败的主要原因. 因此，阐明乳腺癌的浸润、转
3、移机制显得尤为重要. 随着对肿瘤发展分子机制的深入研究，发现黏附分子 Ecadherin(Ecad)和CD44v6 蛋白的表达与肿瘤浸润、转移密切相关1. 恶性肿瘤的重要特征之一就是细胞无限制的生长，细胞 DNA 含量及分布的异常是其生长的物质基础. 所以细胞 DNA 含量的测定对判断肿瘤性质、预后具有重要意义2. 我们通过观察 Ecad 和 CD44v6 在浸润性乳腺癌的表达，以探讨二者与乳腺癌各病理、临床指标间的关系及与 DNA 倍体的相关性，为判断乳腺癌进展及预后提供参考指标.1 材料和方法1.1 材料兰州大学第一医院病理科手术切除女性乳腺癌标本 103例，年龄 2376（平均 48.2
4、）岁. 依据 WHO 标准进行组织学分型：浸润性导管癌 72 例，管内癌为主的浸润性导管癌 11 例，浸润性小叶癌 7 例，髓样癌 13 例. 56 例有随访记录，其中年龄50 岁21 例，50 岁 35 例；肿瘤直径 3cm 者 12 例，3cm 者 44 例；无腋窝淋巴结转移患者 11 例，13 个转移患者 16 例，3 个转移者 29 例；局部复发 14 例，远处转移 20 例. SP 试剂盒、鼠抗人3Ecad 和 CD44v6 单克隆抗体均购自福州迈新生物技术公司.1.2 方法1.2.1 Ecad 和 CD44v6 表达标本经 40 g/L 甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋，连续 4 m
5、薄切片，分别作 HE、免疫组化染色及Feulgen DNA 染色. 免疫组织化学染色采用 SP 法，操作步骤按说明书进行. 以已知阳性切片作阳性对照，阴性对照用 PBS 代替一抗. 按照 BloomRichardson 标准进行组织学分级；组织浸润程度按肿瘤边界清楚度进行分级；无腋窝淋巴结转移为（-）组，13 个腋窝淋巴结转移为（+）组，3 个为（ ）组； CD44v6 以细胞质/膜出现棕色颗粒为阳性细胞，Ecad 计细胞膜棕染为阳性细胞，根据阳性细胞百分率和染色深浅度的乘积分级：阴性（-） 、阳性（+） 、强阳性（ ）.1.2.2DNA 倍体分析 DNA 倍体分析采用 Feulgen 染色，
6、依据欧洲分析病理学会（ESACP ）1995 年提出的标准化方案改进，石蜡切片脱蜡、梯度乙醇入水后用 1 mol/L 盐酸水溶液于 60 处理 8 min，后入 Schiff 液在室温下暗处反应 45 min，亚硫酸水溶液洗涤1 min3 次，流水冲洗，常规脱水封片. 采用 Video Pro32 图像分析系统对 Feulgen 染色切片的癌细胞进行 DNA 含量检测，每例检测 100 个癌细胞核积分吸光度（IA ）值. 同时，检测同一切片 304个淋巴细胞的 IA，以淋巴细胞的平均（P50）IA 值作为二倍体（2C）的对照值. 2C（二倍体）1.25P50，34C（1.252.25）P50
7、，5C （2.252.75）P50. 5C 的细胞作为异倍体细胞 . DNA 含量用 DNA 指数（DI）表示，DI=肿瘤细胞核 IA 均值/淋巴细胞核 IA 均值. 二倍体DI=0.90 1.10，大于或小于此值为异倍体. DI 值不在 0.901.10范围，并且有5C 的细胞，作为判定异倍体的标准.统计学处理: 应用 SPSS10.0 统计软件对资料进行统计学处理，组间均数比较用 t 检验，率的比较用 2 检验. 以 P0.05 为差别有统计学意义.2 结果2.1Ecad 和 CD44v6 表达 Ecad 与 CD44v6 在浸润性乳腺癌组织的表达与组织学分级及组织浸润程度均有密切关系(P
8、0.05） ，与组织学类型无关（P0.05,表 1）. 在 56 例有随访记录的患者中，Ecad 表达与年龄、肿瘤大小、生存时间无关（P0.05） ，与淋巴结转移、复发、远处转移有关系(P0.05） ；CD44v6 表达与年龄无关（P0.05） ，与肿瘤大小、淋巴结转移、复发、远处转移、生存时间均有关系（P0.05,表 1). Ecad 与 CD44v6 在浸润性乳腺癌组织的阳性表达率分别为 35.0%(36/103),76.7%(79/103)，在同一癌组织中二者表达呈负相关. 表 1 浸润性乳腺癌 Ecad 和 CD44v65表达与临床病理指标的关系2.2DNA 异倍体在 Ecad 表达阳
9、性的乳腺癌组织中 DNA 异倍体率为 36.1%(13/36)，表达阴性者异倍体率为 91.0%(61/67)；CD44v6 表达阳性癌组织中异倍体率为 82.3%(65/79)，表达阴性者异倍体率为 45.9%(11/24)，经 2 检验阴、阳性组之间有统计学差异 (P0.01 ）. 在 Ecad 表达阴性、CD44v6 表达阳性癌组织 DI和5C 值均高于 Ecad 表达阳性、CD44v6 表达阴性癌组织 (表 2).表 2CD44v6 和 Ecad 表达与 DNA 含量的关系3 讨论Ecad 是一类介导细胞间相互黏附的钙依赖型跨膜糖蛋白，参与形成和维持正常细胞的极性和组织构架，Ecad
10、蛋白突变和低钙环境可导致细胞解离. 在许多肿瘤中均发现 Ecad 的表达减少或下调，被认为是抑制肿瘤转移的因素3-4. 肿瘤细胞浸润、转移的过程首先是黏附和去黏附的过程，癌细胞侵袭转移首先是由于细胞间同质黏附降低，细胞从原发瘤体分离的结果. 分化良好的癌组织 Ecad 表达多正常，癌细胞之间保持了较好的连接状态，浸润生长较为少见，相反，Ecad 表达下降的癌组织中，癌细胞之间的黏连松散，肿瘤细胞易于脱落离开原发灶而发生浸润和转移. 本研究显示，在浸润性乳腺癌中，Ecad 的阳性表达降低，并与肿瘤的分6化程度、转移潜能和预后有一定关系，与有关文献报道一致5-6. 对其 DNA 倍体的分析表明 E
11、cad 表达阴性的乳腺癌 DI 值和5C值均高，提示 Ecad 表达阳性患者预后较好，Ecad 表达的改变可作为一种评价肿瘤转移潜能的指标. CD44 是一族广泛分布于各种组织细胞表面的跨膜糖蛋白，参与细胞间、细胞与基质间的特异黏附过程. 在本实验中， CD44v6 在浸润性乳腺癌中高表达，并且与组织浸润程度、组织学分级、腋窝淋巴结转、局部复发、远处转移、生存时间等病理临床学指标之间密切相关. 同时研究表明 CD44v6阳性表达与 DNA 含量（DI）呈正相关，提示 CD44v6 可作为乳腺癌浸润、转移的预后指标. 结果还提示 CD44v6 表达与乳腺癌的组织学分级关系密切，而组织学类型之间差
12、异不明显，因而认为组织学分级较单纯分型对判断预后更有意义. Ecad 是介导细胞同质型的黏附分子，而 CD44v6 是介导细胞异质型黏附的主要分子. 本研究显示，浸润性乳腺癌组织中 Ecad 蛋白表达与 CD44v6 蛋白表达之间存在负相关，这与 Kallakury 等7研究结果相一致，表明浸润性乳腺癌易于浸润、转移可能与两者的表达失衡有关.DNA 异倍体的出现是染色体异常的表现，肿瘤细胞核 DNA含量是反映肿瘤恶性程度和生物学行为的重要指标. 细胞 DNA 含量及分布的异常不但加速了细胞分裂增殖，同时导致细胞内特异性多肽和蛋白的合成失败，使细胞不能从增殖状态转变为分化状态. 本实验中，在 E
13、cad 阴性、CD44v6 阳性表达的乳腺癌多为异倍体癌；7Ecad 阳性、 CD44v6 阴性表达者多为二倍体癌. 说明 Ecad 阴性、D44v6 阳性癌增殖活性高于 Ecad 阳性、 CD44v6 阴性癌，进一步提示 Ecad, CD44v6 可作为乳腺癌的判断预后指标. 联合检测Ecad 和 CD44v6 蛋白表达和 DNA 倍体对乳腺癌诊断和判断预后具有一定的意义.【参考文献】 1 Ponta H, Sherman L, Herrlich PA. CD44: From adhesion molecules to signalling regulators J. Nat Rev Mol
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15、es RM, Veve R, Hirsch FR, et al. The Ecadherin cellcell adhesion complex and lung cancer invasion, metastasis, and prognosisJ . Lung Cancer, 2002, 36(2):115-8124.5 Hoteiya T, Hayashi E, Satomura K, et al. Expression of Ecadherin in oral cancer cell lines and its relationship to invasiveness in SCID
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