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1、1海藻糖用于血细胞冻干保存中的研究进展【摘要 】 冰冻干燥方法是保存血细胞最佳的方法，因为冻干的血细胞制品能在常温下保存，性能稳定，保存时间长，便于运输，保存费用低廉等优势，解决了目前血细胞保存的局限性。然而，在冻干过程中血细胞膜的损伤、细胞功能的降低是一个重要的问题。目前，研究者多以海藻糖为保护剂，将海藻糖导入血细胞内，对血细胞进行冻干。本文主要综述冻干对血细胞损伤机理，海藻糖对血细胞冻干过程中的保护机制及海藻糖在血细胞冻干保存中的研究现状。【关键词】 海藻糖Research Progress on Trehalose Used in Lyophilization of Blood Cell
2、s ReviewAbstract Lyophilization is the best method for preservation of blood cells at present.Lyophilized blood cells could be stored at room temperature for long periods of time，while maintaining a high degree of viability.Lyophilized blood cells facilitates transportation and the costs are 2low.Ho
3、wever，the membrane of blood cells is damaged and viability of blood cells is decressed in lyophilization.Trehalose has been shown to protect membrane，proteins and nucleic acids during freezing and desiccation.Now，researchers present a methor for loading blood cells with trehalose.In this paper，damag
4、e effect of lyophilization on blood cells，the mechanism of trehalose protection and the experimantal studies on trehalose were reviewed.Key words trehalose; blood cells; lyophilization目前，红细胞、血小板和造血干细胞的保存多采用常温下的短期保存和深低温的长期保存。此两种保存方法均需要笨重的冰箱和存储设备，保存费用昂贵，在保存和运输进程中受到诸多自然、环境因素的限制，远远不能满足临床应用。由于冻干血细胞能在常温下保
5、存，保存时间长，性能比较稳定，输注方便，保存费用低廉，便于运输等优点，血细胞的冻干保存已成研究热点。冻干红细胞、血小板的研制成功将会改善临床用血短缺状况，对战伤和急诊救助有重大的应用价值；造血干细胞的冻干保存给恶性血液病患者的治疗带来新的曙光。血细胞的冷冻干燥过程一般包含预冻、初级干燥、次级干燥三个3步骤。在此过程中细胞的生存条件、物理状态均发生变化，构成细胞的膜蛋白及磷脂存在一定程度的变性，影响细胞器的功能活动，细胞的生活力下降。如何最大限度的抑制细胞成分的变性，保持细胞原有的活力，一直是血细胞冻干保存研究的重点。存在于一些微生物、低温休眠动物和耐干旱植物中的海藻糖引起人们的关注。海藻糖是葡
6、萄糖的二聚体，是一种非还原性保护剂，在低温、干燥状态下对生物材料有保护作用。是低温生物领域最佳的保护剂。现就海藻糖在血细胞冻干保存中的作用机制及应用现状综述如下。冷冻干燥对血细胞的损伤机制冷冻对血细胞的损伤血细胞在预冻过程中，细胞内的水分结冰，体积膨大，细胞内冰晶对细胞膜及细胞器膜产生机械损伤。细胞外水分结冰、细胞外的溶质浓度升高、 渗透压增高、 pH 值改变，导致构成细胞的蛋白变性、 细胞脱水死亡。 如何减少胞内外冰晶的形成是防止预冻时细胞损伤的关键所在。 低温生物工程大量的实验证明：对不同种类的细胞选择最佳的冷却速率，是细胞内外冰晶生成最少且最小的必要条件1 。生物样品的玻璃化保存是避免冰
7、晶生成的主要措施，也是实现生物体低温保存的主要途径。所谓玻璃化，主要是指液体转变为非晶态（玻璃化）的固化过程，玻璃态固体分子之间的4距离与液态分子间距离没有区别，不形成冰晶。20 世纪 50 年代，Smith 用甘油做保护剂，采用 100/min 的冷却速率，取得了红细胞低温保存的成功，很快用于临床输注。1996 年 Pellerin-Mendes和他的合作者2用海藻糖做保护剂实现了红细胞的玻璃化保存。各项指标均达到临床输注标准。Wolkers 等3人使用保护剂对小鼠血小板进行低温保存，效果较好。一系列的研究，使血细胞的低温保存技术日趋完善。干燥对血细胞的损伤机制无论是红细胞、血小板，还是造血
8、干细胞的深低温保存都是成功的。但研究人员在血细胞的冻干保存研究中发现，在干燥过程中血细胞膜的损伤、细胞内容物的泄露是影响细胞冻干后存活率下降的主要原因。Crowe 与他的合作者4 从龙虾的肌肉中分离出肌腱质网建立细胞膜模型，在膜干燥过程中，膜发生大量的融合，形成许多漏洞。细胞膜上的各种离子通道皆丧失。研究者从分子水平探究原因发现：细胞在干燥过程中，细胞膜失水，膜上的蛋白质与蛋白质之间、蛋白质与脂类之间相互作用，以补偿丢失水分中的氢，导致细胞膜大片融合、破损，内容物外溢5 。其次，细胞在冻干过程中，细胞膜、细胞器膜经历液相向固相的相变过程，即膜脂质的物理状态的改变，从磷脂双层的首基区域除去氢键键
9、合的水，可增加首基的密度，将丙烯酰基拉在一起，增加范德瓦耳斯相互作5用的几率，结果脂类可以从液晶态转变成凝胶态。当再水化时，在室温为凝胶态的干膜又转变成液晶态6 。在这种相位转变过程中，膜的某些部分包装不好就会发生渗漏，细胞内物质外流7 。因此，如何稳定细胞膜，保持血细胞膜的完整性成了血细胞冻干保存的主要目标之一。海藻糖在血细胞冻干保存中的作用机制细胞的冻干包括冰冻和干燥两个过程。研究者一直在寻找一种保护剂，既能有较高的玻璃化温度，在冰冻过程中能降低冰晶和溶质的损伤，又能在干燥过程中代替水分子稳定细胞膜骨架，在干燥样品再水化时降低细胞膜的相变温度，使细胞再水化时不经历膜相变，保持细胞膜的完整性
10、。研究人员发现8 ，自然界有一些微生物，在脱水达 99%时仍能存活数年，这与其大量分泌海藻糖有关，水化后，海藻糖分泌明显降低。大量的以海藻糖为保护剂的低温生物材料冻干保存研究中发现：海藻糖是低温干燥保存最佳的保护剂，其保护机制如下。玻璃态形成玻璃化是细胞、组织、器官低温保存的理想途径，可以避免冰晶和溶质损伤。海藻糖是葡萄糖的二聚体，是一种稳定的非还原6性二糖，有较高的玻璃化温度，很容易形成玻璃态。较高的玻璃化温度避免低温对血细胞膜蛋白质和脂质的损伤，其次，海藻糖形成玻璃态，将细胞膜的蛋白质分子支撑包裹起来，使之不易变形，抑制细胞膜的融合，降低细胞膜通透性4 。海藻糖较高的玻璃化温度使冻干样品的
11、稳定性更强，保存时间长。Esteves 等7分别研究了以海藻糖和其它二糖做保护剂冻干细菌，冻干后的细菌保存在湿润的空气里，以海藻糖做保护剂的冻干样品保存时间长，而以其它二糖为保护剂的冻干样品的细菌膜融合，很快降解，推测这和海藻糖的玻璃化温度高于其它二糖有关。稳定细胞膜Chen 等9将海藻糖导入哺乳动物细胞内，将其冻干，细胞回收率达 90%以上。Crowe 等10从龙虾的肌肉中分理出肌腱质网建立细胞膜模型，实验中发现，在膜干燥过程中，膜发生大量的融合，形成许多漏洞，细胞膜上的各种离子通道皆丧失，但以海藻糖为保护剂，干燥膜时，不但胞膜的形态完整，而且胞膜上的各种离子通道的功能正常。大量的研究揭示：
12、在冻干过程中，海藻糖与胞膜化学基团相互作用，替代水分子与磷脂、蛋白结合，稳定细胞膜骨架。海藻糖的羟基替代水分子的氢与膜蛋白结合，稳定膜蛋白分子结构。同时海藻糖分子小，易于以分子形式填充到蛋白分子的空隙中，有效限制蛋白分子的内部结构变化，避免蛋白的变形7失活5 。降低膜相变温度海藻糖降低膜相变温度，使干燥的血细胞再水化不经历膜的相变，对提高血细胞回收率有重要作用。Crowe 等10以脂质体为模型研究了海藻糖对细胞膜相变温度的影响。脂质体干燥时，其相变温度是 80，再水化时，脂质体膜大量融合，漏出内含物。当以海藻糖为保护剂干燥时，其相变温度下降到-30，再水化时，脂质体膜不经历相变，没有内含物漏出
13、。海藻糖有较高的玻璃化温度和较低的膜相变温度，同时满足了血细胞冻干保存条件，是细胞冻干保存的最佳保护剂。然而，研究表明，海藻糖只有分布于细胞膜内外两侧，才能使冻干的细胞膜保持完整性6 。目前，海藻糖主要有以下几种方法被导入血细胞内：利用细胞内吞法，将海藻糖导入间充质干细胞中；利用细胞内吞法将海藻糖导入血小板内11 ； 利用红细胞膜的热力学特性，将海藻糖导入红细胞内12 。海藻糖导入血细胞内，为血细胞的冻干保存打下了良好的基础。海藻糖在血细胞冻干保存中的研究现状血小板的冰冻干燥研究已经有 50 多年的历史。 2001 年8Wolkers 等3用海藻糖做保护剂，保护血小板，使血小板的冻干保存取得了
14、突破性的进展。这一方法不但冻干、再水化后的血小板存活率达 85%，其功能与新鲜血小板几乎完全相同，而且使冻干血小板在海藻糖干燥保存体系中十分稳定，冻干血小板储存于封闭的氮中很稳定，2 年后血小板回收率达 85%。目前，Wolker 已能够将冻干、再水化后的血小板浓度提高到临床输注的标准。这对血小板临床应用有重要的价值。1989 年 Goodrich13用聚乙烯吡咯烷酮加单糖、聚阴离子化合物配置的保护体系对红细胞进行冰冻干燥，初步显示了红细胞冻干保存的可行性。在近 15 年的红细胞冻干保存研究中，一直未能筛选出高效的冻干保护剂。海藻糖给红细胞的冻干保存带来了新的曙光。大量的实验研究证明：海藻糖只
15、有分布于细胞膜内外两侧，才能使冻干的细胞膜保持完整性9 ，增强细胞对高渗透压和干燥的忍耐力14 ，提高冻干细胞的存活率 15 。红细胞是双面凹陷的无核细胞，不分泌海藻糖，因此如何将海藻糖导入红细胞内，是红细胞冻干保存的第一步。2004 年，Satpathy 等12利用红细胞膜的热力学特性，将红细胞加入海藻糖溶液，在 37下，培育 7小时，红细胞内的海藻糖浓度达 50 mmol/L。导入海藻糖的红细胞的 ATP、2-3 DPG 的含量与新鲜红细胞接近。这为红细胞的冻干保存迈出了重要一步。9造血干细胞主要存在于骨髓、外周及脐血中。由于脐血来源广泛，收集方便，脐血中富含造血干细胞，国外已开展脐血的冻
16、干保存。国内肖洪海等16人从脐血中分离单个核细胞进行冻干保存，细胞回收率达 75%。干细胞是有核细胞，细胞核内有遗传物质，在干细胞的冻干保存中，既要维持细胞膜及细胞核膜的完整性，还要保证细胞核内遗传物质功能的正常发挥。海藻糖因其具有较高的玻璃态温度，有保护细胞膜、核膜、蛋白质和核酸的作用。2004 年，Oliver 等 11利用细胞内吞法，将海藻糖导入间充质干细胞内，同时，研究了各种影响海藻糖吸收的因素，是造血干细胞的冻干保存的良好的开端。海藻糖是葡萄糖的二聚体，因其在人体内不会降解，随尿液排除体外，对人体基本无害，用其做保护剂冻干样品，不用去除保护剂，使用方便，且不会降低去除保护剂带来的细胞回收率下降。其次，海藻糖作为保护剂冻干的样品，生物性能比较稳定，保存时间长，是血细胞保存的最佳保护剂。【参考文献】1 华泽钊，任禾盛.低温生物医学技术.北京：科学出版社.1994：149-151nt
