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1、1海藻糖对液态低温保存血小板保护作用的实验研究作者：崔云，刘璐，黄成垠，尹其华,黄鹰 摘要 目的：研究海藻糖对液态低温（4）保存血小板的保护作用。方法：采集兔心脏血，按常规方法制备浓缩血小板（CP） ，在CP 中加入不同浓度的海藻糖，4 储存，用 51Cr 铬酸钠进行标记后自体回输入兔体内，于回输后 1、24、48 、72h 抽取兔耳动脉血，测定放射性计数率，计算 24、48、72h 血小板存活率，同时设常温对照组及单纯 4储存的低温对照组进行比较。结果：加入不同浓度海藻糖各储存组的血小板寿命明显长于低温对照组，并且随着海藻糖浓度的增加而延长。结论：海藻糖可延长 4液态保存血小板的寿命，对血小
2、板具有保护作用。关键词海藻糖；血小板；液态；储存；4；51 铬Abstract：Objective To study the protection of trehalose for liquid rabbit platelets stored at 4 traced by 51Cr. Methods Cardiac blood was taken and made into concentrated platelet(CP).CP were stored at different conditions,such as low temperature and low temperature+di
3、fferent dose of trehalose for 24h.Platelets 2were transfused into rabbits bodies after being labelled with 51Cr and platelet lifespan of 24,48,72h was calculated. Results After trehalose was added into the platelets stored at 4,the lifespan was obviously longer than that of platelets stored at low t
4、emperature. And with the dose increasing,the lifespan of platelets wes prolonged obviously till the dose was more than 50mgml-1. Conclusion Trehalose， protecting platelets, can prolong the lifespan of liquid platelets stored at low temperature.Key words：trehalose; platelet; liquid;storage; 4; 51Cr 海
5、藻糖对液态低温保存血小板保护作用的实验研究在对大量失血和化疗、放疗等处理造成血小板减少患者的治疗过程中,需要进行血小板输注。血小板在储存过程中存在的一些不足，使之不能适应临床需求，如：22 常温振荡储存易使血小板遭受细菌污染，污染几率是低温储存的 50 倍，输入体内后可能会造成机体脓毒性败血症，并且储存时间短于 5d；深低温可长期大量储存血小板 ,并能够进行远距离运输,有效利用全血中的血小板成分，但血小板深低温储存时所用的保护剂二甲基亚砜（DMSO）对患者有毒副作用，在洗涤去除 DMSO 的过程中，血小板易被激活、损伤而丧失其临床应用价值 1 。3近年来，血小板液态低温保存倍受关注。随着对液态
6、低温下血小板诱导活化及在体内清除机制研究的不断深入，血小板保存技术取得了突破性的进展。液态低温可使血小板被激活、损伤，寿命缩短。海藻糖（trehalose）是一种非还原性双糖，能抑制寒冷所致的血小板膜侧向分离和血小板聚集1 ，阻止血小板活化、损伤，是很有潜力的血小板低温保护剂。本实验采用同位素 51Cr 示踪技术对海藻糖是否可延长 4 液态储存中血小板的寿命进行探索。1 材料和方法1.1 主要材料海藻糖：C12H22O112H2O，相对分子质量378.33，上海恒信化学试剂有限公司（原上海试剂二厂）生产；ACD 抗凝剂：型号 DIN00788139，美国 Baxter Fenwal 公司生产；
7、GC911 放射免疫计数器：科大创新股份有限公司中佳分公司生产。2.02.5kg 健康雄性新西兰大白兔 21 只，912 月龄，由东南大学医学院实验动物中心提供。1.2 方法41.2.1 制备浓缩血小板（CP） 每只兔取 10ml 心脏血，与 1.5ml ACD 抗凝剂混匀， 1000 rmin-1 离心 10min；取上层血浆至另一离心管中，再以3000 rmin-1 离心 20min（22 ） ；之后将上层血浆移至另一试管中备用，下层血小板中加备用自体血浆 1ml，使血小板悬浮。1.2.2 储存 CP 第 1 组（常温对照组）：将以上制备的 CP 置于 22水浴锅中温浴 24h；第 2 组
8、（低温对照组）：将以上制备的 CP 置于 4冰箱储存 24h；第 38 组：CP 中依次加入浓度为20、30、40、50、60 及 70mgml-1 的海藻糖 1ml，混匀，37水浴锅中温浴后于 4 冰箱储存 24h。1.2.3 标记血小板 取出储存的 CP，于室温（22）下以 3000rmin-1 离心 20min，弃上清，加生理盐水 1ml，使血小板悬浮，然后加入1.11MBq Na251CrO4，37水浴锅中温浴 45min，其间振荡数次；之后再以 3000rmin-1 离心 20min，弃上清，加备用自体血浆 1ml，使血小板悬浮2 。51.2.4 血小板回输 将以上标记好的 1ml
9、血小板通过兔耳缘静脉自体回输入兔体内，于回输后 1、24、48、72h 抽取 1ml 兔耳动脉血，测定放射性计数率，并以 1h 时血液的放射性计数率作为 100%，计算24、48、72h 血小板存活率。1.2.5 Na251CrO4 放射性计数率与标准活度换算 根据公式 A=lg1（lgC-b ） ，将测量所得的动物器官组织样本的 计数率值换算成动物器官组织样本的放射性摄取（ID%g-1） 。1.3 统计学处理所得数据以s 表示，采用 t 检验进行统计分析。2 结果4 储存的低温对照组血小板各时间段的存活率非常低，24h存活率只有(6.382.88)%, 72h 时只有（3.861.06）%，
10、说明 46储存的血小板输入体内后寿命很短。加入不同浓度海藻糖 4 24h储存各组（第 38 组）各时间段血小板存活率明显高于 4储存的低温对照组（P0.05） ，并且随着海藻糖浓度的增加，各时间段存活率也增加，当浓度达到 50mgml -1 时，24、48 及72h 存活率分别达到（ 59.162.05）%、 （51.952.81 ）%及（40.442.43）%，并且超过此浓度，各时间段存活率不再增加，即 50mgml-1 海藻糖组与 60、70mgml -1海藻糖组无明显差异。见表 1。表 1 不同储存条件下血小板的存活率（略）3 讨论研究表明，低温下血小板的生理学性质及形态会发生改变，使其
11、被活化、损伤，寿命缩短1,3 。当它们置于低温下时，形态会从正常的铁饼状变成圆球状，周边形成许多伪足，同时伴有血小板胞浆内的钙离子明显增加，微管解聚，肌动蛋白增加 5 倍以上。此外，血小板 4低温保存 24h 以上会出现 颗粒的聚集和释放，类似于血小板正常生理激活过程，之后血小板几乎失去活性。胞浆内钙离子的迅速增加及骨架肌动蛋白的集结装配，不仅使血小板形态发生异常改变,还可以使其膜发生脂相转移,导致侧向分离,使细胞膜通透性增加,一些离子通过离子通道不受控制而进入细胞内,最终结7果是出现蛋白变性和水肿、自由基过度产生、细胞骨架改变等现象,使血小板容易被激活。膜侧向分离可形成许多小的集团,这些集团
12、由一些排列整齐的膜蛋白组成。研究者将这些小的集团分离出来后,发现其中包含有血小板凝血酶蛋白受体 CD36 及非受体类酪氨酸激酶类 src、lyn 及 fyn,表明这些集团在细胞信号通路中起着一定作用,并且通常是使血小板激活的信号通路,在没有凝血酶存在的情况下可使血小板发生异常激活4 。海藻糖是一种天然存在的非还原性双糖,无论是内源性还是外源性, 对生物体和生物大分子都具有良好的非特异性保护作用,还能够有效抑制寒冷所致的血小板膜侧向分离和血小板聚集1 ，因此，近年来倍受人们关注，成为一种很有潜力的血小板低温保护剂。以往海藻糖都是作为血小板冷冻干燥保存保护剂，并且显示出良好的应用前景。但是，冷冻干
13、燥保存再水化过程容易使血小板形态结构、表面糖蛋白发生改变，不可避免地发生血小板的激活、损伤。因此，近年来许多研究者对液态保存血小板进行新的尝试,如在 4液态保存血小板中加入抑制细胞骨架肌动蛋白、第二信使抑制剂、海藻糖和抗冻蛋白等,防止血小板受到激活而损伤5 。本实验即对液态低温血小板中加入海藻糖进行研究，结果发现，血小板加海藻糖 4 24h 储存各组各时间段血小板存活率明显高于 4储存组（P 0.05） ，说明海藻糖可有效延长液态低温储存后血小板在体内的寿命。其原因在于海藻糖可防止蛋白质变性，抑制低温下血小板8膜侧向分离及损伤。海藻糖与葡萄糖及蔗糖一样,其羟基也能代替水分子同蛋白质分子表面部分
14、结合,对蛋白质形成保护,同时海藻糖的分子较小,易于以分子形式填充到蛋白质分子的空隙中,有效限制蛋白质分子内部的结构发生变化,从而避免蛋白质变性失活6 。低温下, 海藻糖可作为一种水分替代分子,避免血小板生物膜发生固相液相转变、侧向分离，防止血小板活化而寿命缩短7 。此外，本实验结果显示，加入不同浓度海藻糖低温储存各组血小板寿命虽均低于常温对照组，但常温下血小板容易受细菌污染，储存时间短于 5d，而海藻糖对血小板有良好保护作用的同时，还能使血小板长时间储存，可满足临床上对血小板的大量需求。总之，海藻糖对液态低温下血小板的寿命有较明显的延长作用，因此，海藻糖在血小板液态低温储存中具有一定的应用前景
15、。相信本实验将为血小板储存技术的发展及其适应临床需求提供依据。参考文献1TABLIN F, WOLKERS W F, WALKER N J, et al. Membrane reorganization during chilling: implications for longterm stabilization of plateletsJ. Cyobiology, 2001, 43(2): 114123.92李家增，王鸿利，韩忠朝. 血液实验学M .上海：上海科学技术出版社，1997：304.3GOUSSET K, TSVETCOVA N M， CROWE J H, et al. Sele
16、ctive partitioning of receptors and signaling molecules in raft membrane domains of human plateletsJ. Mol Biol Cell, 2001,12(2): 332333. 4GOUSSET K, WOLKERS W F, TSVETCOVA N M, et al. Evidence for a physiological role of membrane rafts in human platelets J. J Cell Physiol, 2002, 190(1):117128.5周俊，刘景汉. 血小板冻干保存的研究进展J. 中国实验血液学杂志，2004，12（4）：542545.6周俊，刘景汉，欧阳锡林，等.血小板胞内
