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1、 前 言 华华法林的缺点 优点优点 缺点缺点 治疗窗窄 难以掌握用药的合理 剂量 易出现抗凝不足或过量 作用时间长 服用方便 副作用 小 价低 预防和治疗血栓形成和复发 华 法 林 用途用途 研究背景研究背景 遗传药理学遗传药理学 分子生物学分子生物学 基因个体化给药方案基因个体化给药方案 个体差异个体差异 研究背景研究背景 VKORCVKORC 华法林华法林 无活性的 凝血因子 VitK环氧型 由VKORC1 编码 有活性的 凝血因子 VitK氢醌型 药物代谢酶 CYP2C9 3 研究目的研究目的 本研究选取中国汉族人群为研究对象 探讨 CYP2C9 3 VKORC1基因在中国汉族人群的 分
2、布情况 同时分析这些基因的多态性 遗传 因素 以及患者的基线信息 非遗传因素 与 华法林用药剂量之间的关系 以期建立适合中 国汉族人群的华法林基因给药模型 材料与方法 主要试剂主要试剂 DNA提取试剂试剂 盒 DNA纯纯化试剂试剂 盒 引物 dNTP buffer Taq酶 限制性内切酶 琼琼脂糖 Tris 硼酸 EDTA 上海赛赛百盛基因技术术有限公司 TIANGEN 上海英潍潍捷基贸贸易有限公司 北京全式金生物技术术有限公司 Fermentas GENE TECH Sunshine 主要仪器主要仪器 F2 Q2型旋涡涡混合器 台式高速离心机 20 冰箱 电电子天平 电电泳仪仪 PCR仪仪
3、微量移液器 DNA测测序仪仪 江苏苏泰县县医疗疗器械厂 Eppendorf Germany Hair Sartorious USA Bio rad Applied Biosystems 2720 Thermo Electron ABI 3130 x 病例选择病例选择 年龄大于18周岁 需要华法林治疗并要求维持INR在 1 8 2 5之间 患者需要长期服用抗凝药华法林至少3 个月以上 INR值稳定 连续3次复查INR均达到目 标INR范围内 中国汉族人 心功能 级或以上 妊娠期及哺乳期妇女 近30天 内参与其他干预试验者 长期合并应用与华法林有 相互作用的药物者 如 三周内服用利福平者 因 伴有
4、合并症而不能使用标准剂量者 如 肝 肾功 能不全等 纳入 排除 实验流程实验流程 样本取血 228例 目标基因片段PCR扩增 CYP2C9 VKORC1 纳入及排除目标 病例 收集病人的基线信息 基因组DNA提取 确定病例基因型 伦理委员会 研究注册 由遗传及非遗传因素 建立华法林给药模型 比较不同基因型个体 用药剂量的差异 数据统计 实验内容实验内容 采集患者信息 基因分型 基线信息 DNA采集 CYP2C9 3 VKORC1 确定基因类型PCR扩增 基因的多态性与华法林用药剂量之间的关系 实验内容实验内容 比较不同种族间CYP2C9 3 VKORC1 基因分布频率 分析CYP2C9 3 V
5、KORC1基因多态性 与华法林维持剂量间的关系 实验内容实验内容 因变量为华法林日剂量 mg d 自变量包括年龄 性别 身高 体重 CYP2C9 VKORC1基因型 多元回归统计方法 制定给药模型 统计学分析统计学分析 实验数据采用SPSS17 0统计软件分析 应用基因计数法计算基因型频率和等位基因频率 基因频率 和等位基因频率采用同组中构成比比较的 2检验 患者与Hardy Weinberg H W 平衡的符合程度采用 2 检验 P 0 05 样本具有群体代表性 计量资料数据采用mean SD 不同基因型间华法林剂量比较采用t检验 P 0 05 差异有统计学意义 结果与讨论 表1 CYP2C
6、9 3基因分布频率 n 228 CYP2C9 3 AA AC CC C A 基因型频频率 219 96 05 9 3 95 0 0 00 等位基因频频率 1 98 98 02 实验结果实验结果 注 华法林抗凝治疗人群中 CYP2C9 3基因以AA型为主 AC和CC型少见 表2 患者CYP2C9 3基因多态性与H W平衡的 符合程度检验 n 228 基因型 观观察值值 期望值值 AA 219 219 08 AC 9 8 82 CC 0 0 09 2 0 09 P 0 05 表3 不同种族CYP2C9 3基因型频率及等位基 因分布频率对比 地区 CYP2C9 3基因型频频率CYP2C9 3等位基因
7、分布频频率 AAACCCAC 中国汉汉族 11 7 15 94 105 300 6097 003 00 我国维维吾尔族 16 80 322 6617 0281 6518 35 美国 17 84 5814 740 6891 958 05 意大利 18 80 9517 461 5989 6810 32 俄罗罗斯 19 85 6013 980 4292 587 42 本次研究96 053 950 0098 021 98 表4 VKORC1基因分布频率 n 228 VKORC1 AA AG GG G A 基因型频频率 191 83 77 35 15 35 2 0 88 等位基因频频率 8 55 91
8、45 注 华法林抗凝治疗人群中 VKORC1基因以AA和AG型为主 GG型少见 表5 患者VKORC1基因多态性与H W平衡的 符合程度检验 n 228 基因型 观观察值值 期望值值 AA 191 190 67 AG 35 35 66 GG 2 1 66 2 0 09 P 0 05 表6 不同种族 VKORC1基因频率分布情况对比 研究人群AA型AG型GG型 高加索人 20 中国汉汉族人 20 我国台湾 20 我国维维吾尔族 21 日本 22 14 20 19 00 79 80 81 30 74 00 83 70 39 50 56 00 18 30 18 70 26 00 15 50 25 0
9、0 45 50 1 90 0 00 0 00 0 80 本次研究83 7715 350 88 表7 不同基因型间的患者基本情况比较 注 CYP2C9 3 AA和AC型华法林平均剂量比较 P 0 05 VKORC1 AA和AG GG华法林平均剂量比较 P 0 05 基因型 例数 年龄龄 age 体重 kg 身高 cm 平均日剂剂量 mg d CYP2C9 3 AA 219 AC CC 9 VKORC1 AA 191 AG GG 37 49 4 11 8 55 1 12 3 50 3 10 4 46 5 12 7 60 0 11 5 58 2 11 0 60 2 11 2 58 3 12 6 16
10、2 3 8 0 158 7 6 5 161 7 7 8 164 1 8 4 2 95 1 37 1 70 0 60 2 65 1 04 4 18 2 01 表8 不同年龄段患者的华法林用药剂量比较 患者情况年龄龄 50 113 年龄龄 50 115 P 平均体重 kg 平均身高 cm 平均日剂剂量 mg d 59 4 11 1 60 4 11 8 0 05 160 0 7 3 161 2 8 0 0 05 2 54 1 1 3 26 1 5 0 05 图1 不同CYP2C9 3 VKORC1基因型患者间的剂量比较 AA and AA AA and AG AA and GG AC and AA
11、AC and AG n 183 n 34 n 2 n 8 n 1 表9 患者基线信息的单因素回归分析 变量 平均值 相关系数 P值 性别 sex 年龄 age 身高 cm 体重 kg CYP2C9 3 VKORC1 0 001 0 038 0 035 0 008 1 249 1 644 0 994 0 01 0 01 0 309 0 01 0 01 49 65 11 87 162 11 7 95 59 93 11 42 表10 多元回归统计方法制定给药模型 方程R2P值值 Dose mg d 1 39 0 034A 0 021H Dose mg d 2 378 0 033A 0 02H 0 9
12、92C Dose mg d 0 35 0 29A 0 014H 1 5 VK Dose mg d 1 545 0 028A 0 012H 0 955C 1 495VK Dose mg d 2 33 0 306S 0 027A 0 008W 0 017H 0 063C 1 501 VK 0 121 0 14 0 308 0 326 0 334 0 01 0 01 0 01 0 01 0 01 结结 论论 本实验条件下 228例华法林抗凝治疗患者中 CYP2C9 3 VKROC1基 因存在多态性 基因频率与其他种族存在一定的差异 CYP2C9 3基因突变的个体所需华法林的日平均剂量低于 野生基因型的个体 VKROC1基因的突变导致患者服用华法林的剂量增加 非遗传因素中 患者的年龄 身高与华法林用药剂量存在 相关性 本实验条件下 本研究得出的华法林个体化给药模型 Dose mg d 2 33 0 306Sex 0 027Age 0 008Weight 0 017Height 0 063CYP2C9 3 1 501 VKORC1可解 释 33 4 的剂量差异 本研究只能解释33 4 的华法林剂量差异 这提示我们 要就影响华法林发挥抗凝活性的遗传及非遗传因素进行 扩大研究 结结 论论
