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1、1汉滩型与希望山型汉坦病毒的体外重组作者：康文臻，黄长形，白雪帆，杨为松，谢玉梅，郝春秋，张岩 【关键词】汉坦病毒 关键词 :汉坦病毒;肾综合征出血热; 空斑实验 ;基因重组;聚合酶链式反应 摘要 :目的探明汉坦病毒汉滩型与希望山型之间能否发生基因重排，以及发生重排的频率和特点.方法用汉坦病毒汉滩型 76-118 株与希望山型 PHV 株混合感染 VeroE6 细胞，空斑形成实验挑取子代病毒克隆株，传代培养后用 RT-PCR 方法鉴定子代病毒基因型.结果子代病毒 14/36 来源于 PHV 株;12/36 来源于 76-118 株;5/36 汉滩型与希望山型分型引物扩增均为阳性;1 株子代病毒
2、 L，S 片断均来源于76-118 株，而 M 片段两种引物扩增均为阳性;2 株子代病毒 L 片断来源于 76-118 株，S 片断来源于 PHV 株，M 片段两种引物扩增均为阳性.1 株子代病毒 L，S 片断均来源于 76-118 株，而 M 片段来源于 PHV 株.结论汉坦病毒汉滩型与希望山型之间可以发生基因片段的重排. Keywords:hantavirus;recombination，genetic;polymerasechainreaction 2Abstract:AIMTodeterminethefrequencyandcharacteris-ticsofgenesegmentsr
3、eassortmentbetweenHantaanvirusandProspectHillvirus.METHODSMixedinfectionswereinitiatedintissueculturebyusingHantaanvirusstrains（76-118 ）andProspectHillVirusStrains（PHV ）.Potentialreas-sortantvirusplaqueswerescreenedbymultiplexRT-PCR，usingprimersspecificforindividualgenomesegmentsofeachstrain.RESULTS
4、Mostoftheprogenyvirusplaques（28of36）hadtheparentalgenotypeof76-118strainorPHVstrain.5of36plaqueshadmixedgenotypesthatyieldedRT-PCRbandsforthesamesegmentofbothparentalstrains.Reassortantvirusesweredetectedin4of36progenyplaquestested.Inaddition，approximately8.33%oftheprogenyvirusplaquesappearedtoconta
5、inMsegmentsoriginatingfrombothparentalvirusstrains，i.e.，theywerediploid.CONCLUSIONGeneticreassortmentcanoccurbetweenHantaanvirusstrainsandProspectHillvirusstrains. 0 引言 人们发现当将两个不同的布尼亚病毒株同时感染同一宿主或3细胞时，它们之间的基因片段可以重新组合，即发生基因重排.近年来汉坦病毒的基因重排国外已有报道1， 2.我们探明汉坦病毒汉滩型（型，Hantaanvirus ）和希望山型（ 型，ProspectHillviru
6、s）之间基因片段能否重组如下. 1 材料和方法 1.1 材料汉坦病毒 76-118 株，PHV 株，Viro-E6 细胞均由中国药品生物制品药品检定所提供.1.2 方法将汉坦病毒 76-118 株和 PHV 株等量同时接种至 Viro-E6 细胞，在感染病毒 6d 后每日刮片检测病毒抗原（免疫荧光法:一抗为患者血清，二抗为免疫标记抗人 IgG） ，当荧光达到时，将细胞及上清冻融 3 次，离心取上清备用. 在 4 条件下，将 76-118 和 PHV 混种的毒种做 10 倍系列稀释，选取 10-4，10-5 ，10-63 个稀释度接种于 6 孔板的 VeroE6 细胞单层上（0.4mL/ 孔）进
7、行空斑形成实验7 ，每个稀释度两孔，37吸附 1h，加第 1 层琼脂培养基， 6d 后加第 2 层琼脂培养基（含中性红 1300） ，24 48h 观察空斑形成情况并用毛吸管挑取空斑 36个. 将挑取的空斑分别加入 VeroE6 细胞中培养，至培养 7，10d 分别刮片检测病毒抗原（免疫荧光法:一抗为患者血清，二抗为免疫标记抗人 IgG）.10d 后将培养的毒株分别收获，冻融后分别再次接种至 VeroE6 细胞，至培养 6d 后每日刮片检测病毒抗原（免疫荧光法:一抗为患者血清，二抗为免疫标记抗人 IgG） ，8d 收获，冻融后加4200mLL-1 小牛血清-70 冻存.700LTrizol（G
8、ico 公司产品）加300L 毒株培养上清，混匀后室温静置 5min，加氯仿 200L，混匀后室温静置 23min ，11000g4离心 15min，移水相至新 EP管加入 500L 异丙醇沉淀 RNA，混匀后室温静置10min，11000g4 离心 10min 后弃上清，1mL750mLL-1 乙醇洗沉淀，100120g4 离心 5min，室温干燥 10min，10LDEPC处理的水重溶，5560水浴助溶. 取 10L 提取的 RNA 进行 RT反应，RT 反应用 Promege 反转录试剂盒，按试剂使用说明操作.PCR 引物设计在 GeneBank 上获取汉滩型和希望山型 L，M ，S 片
9、段的基因序列，对比分析，分别设计汉滩型和希望山型 L，M ，S 片段的分型引物.R 为反转录引物，序列为 :5-TAGTAGTAGAC-3（111 ， 11bp）.L1，M1，S1 分别为汉滩型和希望山型病毒L，M，S 片段共同的上游引物;L2，M2 ，S2 分别为 L，M ，S 片段汉滩型的分型下游引物;L3，M3 ，S3 分别为 L，M ，S 片段的希望山型分型下游引物.均由上海生物技术中心合成（Tab1）.PCR 反应:底物 2LRT 产物 Primer 各 1LdNTP（2.5mmol）2LBuffer（101）2LMgCl2（25mmol）2LTqe2UH2O12.5L 循环参数为:94 变性 5min，941min，551min，721min，35 个循环后， 72 延伸 10min.取 10LPCR 产物，15gL-1 的琼脂糖凝胶电泳，100bp 梯度Marker 作相对分子质量对照，观察是否有 PCR 产物及产物带大小.
