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1、血清碱性磷酸酶活力测定血清碱性磷酸酶活力测定 磷酸苯二钠法磷酸苯二钠法 1 1 n n 酶活力 也称酶活性 是表示催化某一特定反应的酶活力 也称酶活性 是表示催化某一特定反应的 能力 可以用在一定条件下所催化的某一特定化学能力 可以用在一定条件下所催化的某一特定化学 速度表示 速度表示 酶催化反应速度越快 酶活力升高 反之活力愈酶催化反应速度越快 酶活力升高 反之活力愈 低 低 底物减少量或生成物增加量底物减少量或生成物增加量 n n 酶促反应速度酶促反应速度 单位时间单位时间 2 2 n n 酶的活力单位酶的活力单位 国际单位 国际单位 KatalKatal 1s1s转化转化1mol1mol
2、底物的酶量底物的酶量 临床表示 临床表示 KingsKings 如血清谷丙转氨酶活力单位 每 如血清谷丙转氨酶活力单位 每100ml100ml血血 清在清在37 37 pH 7 4pH 7 4的条件下与底物作用的条件下与底物作用60min60min 生成 生成 1 mol1 mol丙酮酸所需的酶量为丙酮酸所需的酶量为1 1个活力单位个活力单位 n n 酶的比活力 单位质量酶蛋白或单位体积酶制剂所含有酶酶的比活力 单位质量酶蛋白或单位体积酶制剂所含有酶 活力单位数 即酶活力浓度 活力单位数 即酶活力浓度 n n 酶活力的测定方法酶活力的测定方法 1 1 终止测定法 定时法或终点法 终止测定法 定
3、时法或终点法 2 2 动力学分析法 连续监测法或速率法 动力学分析法 连续监测法或速率法 3 3 实验目的实验目的 n n 熟悉酶活性测定方法的一般原理熟悉酶活性测定方法的一般原理 n n 掌握血清掌握血清ALPALP测定原理与临床意义测定原理与临床意义 4 4 实验原理实验原理 n n 碱性磷酸酶在碱性环境中作用于磷酸苯二钠 使碱性磷酸酶在碱性环境中作用于磷酸苯二钠 使 之水解生成酚和磷酸 酚在碱性溶液中与之水解生成酚和磷酸 酚在碱性溶液中与4 4 氨基氨基 安替比林作用 经铁氰化钾氧化形成红色醌类化安替比林作用 经铁氰化钾氧化形成红色醌类化 合物 其颜色深浅与合物 其颜色深浅与ALPALP
4、活性成正比 活性成正比 n n 磷酸苯二钠磷酸苯二钠 H H 2 2 OO 苯酚苯酚 磷酸氢二钠磷酸氢二钠 n n 苯酚苯酚 4 4 氨基安替比林氨基安替比林 红色醌亚胺衍生物红色醌亚胺衍生物 ALP pH 1 0 铁氰化钾 5 5 实验器材和试剂 实验器材和试剂 n n 一 器材 一 器材 5ml5ml移液管 移液管 1ml1ml移液管 移液管 100100或或200ul200ul微量可调式移液器微量可调式移液器 721E721E分光光度计 分光光度计 1cm1cm比色皿 比色皿 37 37 恒温水浴恒温水浴 n n 二 试剂 二 试剂 n n 1 1 0 1mol L0 1mol L碳酸盐
5、缓冲液碳酸盐缓冲液 pH10 0 pH10 0 称取无水碳酸钠称取无水碳酸钠 6 36g6 36g 碳酸氢钠 碳酸氢钠3 36g3 36g 4 4 氨基安替比林氨基安替比林1 5g1 5g 溶于 溶于 800mL800mL蒸馏水中 定容蒸馏水中 定容至至1 1L L 置棕色瓶中保存 置棕色瓶中保存 n n 2 2 20mmol L20mmol L磷酸苯二钠溶液磷酸苯二钠溶液 先将先将5 500ml00ml蒸馏水煮蒸馏水煮 沸 迅速加入沸 迅速加入磷酸苯二钠磷酸苯二钠2 18g 2 18g 磷酸苯二钠如含磷酸苯二钠如含2 2分子结分子结 晶水 则应称取晶水 则应称取2 54g 2 54g 冷却后
6、加氯仿 冷却后加氯仿2ml2ml防腐 在防腐 在4 4 冰箱保存 用剩的溶液不应再倒回瓶中 冰箱保存 用剩的溶液不应再倒回瓶中 n n 3 3 铁氰化钾的硼酸溶液 铁氰化钾的硼酸溶液 称取铁氰化钾称取铁氰化钾2 5g2 5g 硼酸 硼酸17g17g 各自溶于蒸馏水 各自溶于蒸馏水400ml400ml中 两液混合后 加蒸馏水至中 两液混合后 加蒸馏水至1 1L L 置棕色瓶中避光保存 置棕色瓶中避光保存 如出现蓝绿色即弃去如出现蓝绿色即弃去 n n 4 4 酚标准工作液 酚标准工作液 0 05mg ml0 05mg ml 购买合格的二级购买合格的二级 标准品 标准品 6 6 实验操作实验操作 1
7、 1 取试管取试管4 4支 按下表操作支 按下表操作 测定管测定管标准管标准管空白管空白管对照管对照管 血清 血清 mlml 0 1000 100 酚标准液酚标准液 0 1000 100 蒸馏水蒸馏水 0 1000 100 pH10pH10碳酸盐缓冲液碳酸盐缓冲液1 001 001 001 001 001 001 001 00 混匀 混匀 3737 水浴保温水浴保温5min5min 同时将底物预热 同时将底物预热 底物液底物液1 001 001 001 001 001 001 001 00 混匀 混匀 3737 水浴保护水浴保护15min15min 铁氰化钾溶液铁氰化钾溶液3 003 003
8、003 003 003 003 003 00 血清血清 0 1000 100 2 立即混匀 在510nm波长处比色 以蒸馏水调零点 读取 各管吸光度 7 7 n n 计算计算 ALPALP活性活性 A A测定 测定 A A对照对照 A A标准标准 A A空白空白 0 05 100 0 05 100 金氏单位 金氏单位 8 8 临床意义 临床意义 血清中血清中ALPALP活力测定在临床常作为肝胆疾病和骨骼疾病的临活力测定在临床常作为肝胆疾病和骨骼疾病的临 床辅助诊断指标 床辅助诊断指标 1 1 血清血清ALPALP活性升高可能原因如下活性升高可能原因如下 肝胆疾病 阻塞性肝胆疾病 阻塞性 黄疸
9、急性或慢性黄疸性肝炎 肝癌等 黄疸 急性或慢性黄疸性肝炎 肝癌等 骨骼疾病 由骨骼疾病 由 于骨的损伤或疾病使成骨细胞内所含高浓度的于骨的损伤或疾病使成骨细胞内所含高浓度的ALPALP释放进释放进 入血液中 引起血清入血液中 引起血清ALPALP活性增高 如纤维性骨炎 成骨活性增高 如纤维性骨炎 成骨 不全症 佝偻病 骨软化病 骨转移癌和骨折修复愈合期不全症 佝偻病 骨软化病 骨转移癌和骨折修复愈合期 等 等 2 2 血清血清ALPALP活性降低比较少见活性降低比较少见 主要见于呆小病 重症慢主要见于呆小病 重症慢 性肾炎 乳糜泻 贫血 恶病质等 性肾炎 乳糜泻 贫血 恶病质等 9 9 注意事
10、项注意事项 1 1 目前市售的酚标准液多数为安瓿瓶 开后不能目前市售的酚标准液多数为安瓿瓶 开后不能 久置久置 2 2 底物液中不应含有酚 如空白管显红色 说明底物液中不应含有酚 如空白管显红色 说明 磷酸苯二钠已分解 不宜使用 磷酸苯二钠已分解 不宜使用 3 3 加入铁氰化钾后必须迅速混匀 否则对实验结加入铁氰化钾后必须迅速混匀 否则对实验结 果会有影响 果会有影响 1010 标准曲线法标准曲线法 n n 制备如下 制备如下 取试管取试管6 6支 分别加酚标准液支 分别加酚标准液 1ml 0 1ml 0 1mg 1mg 0 0 0 050 05 0 10 1 0 20 2 0 30 3 0
11、4ml0 4ml 各 各 管依次加复合基质液管依次加复合基质液3 13 1 3 053 05 3 03 0 2 92 9 2 82 8 2 7ml2 7ml 混匀后 混匀后37 37 水浴保温水浴保温5 5分钟 各管加入分钟 各管加入 1 0ml1 0ml碱性溶液 再加碱性溶液 再加0 50 5 铁氰化钾 铁氰化钾2 0ml2 0ml 立即 立即 混匀 静置混匀 静置1010分钟 分钟 510nm510nm波长下比色 将以上波长下比色 将以上 各管所得读数与其相应的碱性磷酸酶单位各管所得读数与其相应的碱性磷酸酶单位 依次为依次为 0 50 5 1010 2020 3030 4040单位单位 在坐标纸上作图 绘在坐标纸上作图 绘 制成标准曲线 制成标准曲线 1111 1212
