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1、免疫电泳技术免疫电泳技术 四川大学华西医院临床免疫室四川大学华西医院临床免疫室 武永康武永康 1 一 免疫电泳技术的发展一 免疫电泳技术的发展 二 免疫电泳技术的相关概念二 免疫电泳技术的相关概念 三 介绍几种经典的免疫电泳技术 重点 三 介绍几种经典的免疫电泳技术 重点 四 凝胶免疫电泳技术要点四 凝胶免疫电泳技术要点 五 免疫增殖性疾病及免疫检测五 免疫增殖性疾病及免疫检测 本课内容 2 免疫电泳技术免疫电泳技术 1953年Grabar和Williams将凝胶扩散置于 直流电场中 让电流来加速抗原与抗体的扩散 并规定其运动方向 并与免疫沉淀反应相结合 从而加快了沉淀反应的速度 建立了免疫电
2、 泳技术 之后又衍生出对流免疫电泳 火箭电 泳 及免疫固定电泳等新方法 一 免疫电泳技术的发展 3 琼脂电泳与免疫扩散沉淀技术相结合的一门技术 K 1 电泳优点 1 将蛋白电泳分开 2 加快反应速度 2 沉淀反应 一 免疫电泳技术的定义 二 免疫电泳技术的相关概念 免疫电泳分析 immunoelectrophoresis 4 蛋白质具有可解离的酸性和碱性基团 在一 定PH值条件下 使蛋白质分子带正电荷或负电荷 在电场中 带正电荷的粒子向负极移动 而带 负电荷的粒子向正极移动 由于各种蛋白质迁移 率不同而分为不同的区带 二 电泳的基本原理及其影响因素 I 基本原理 电泳 electrophore
3、sis 带电颗粒在电场 中通过液体介质的移动 称为电泳 5 1 颗粒 蛋白 本身特性 两性 大小 形状 2 载体性质 最常用的载体是琼脂和琼脂糖凝胶 3 电场强度 4 溶液PH值及离子强度 缓冲液的作用 最适电泳缓冲液0 05M PH8 6 巴比妥缓冲液 II 电泳的影响因素 6 5 电渗 主要与载体特性有关 电渗定义 电渗方向与电泳方向的关系 J 电泳迁移率 指在同一电场条件下 各种带电 粒子在单位时间内移动的距离 6 电源 7 定 义 区带电泳 免疫双扩散 K 基本原理 在电场作用下 将标本于琼脂凝胶中 进行区带电泳 电泳结束后 于琼脂 板旁挖一长形槽 加入相应抗血清 抗体呈直线扩散 电泳
4、分离后的各种 抗原呈放射状扩散 反应生成弧状沉 淀线 1 免疫电泳 三 介绍几种经典的免疫电泳技术 8 免疫电泳 将蛋白质抗原在琼脂平板上进行 电泳 使不同的抗原彼此分离 撤去电压 在与电泳方向平行 的琼脂打槽并加入相应抗体进 行双向免疫分散 分离成区带的各种抗原成分与相 应抗体在琼脂中扩散后相遇 在 二者比例合适处形成弧形沉淀线 据沉淀线的数量 位置和形状 与已知的正常人沉淀线比较 即可对样品中所含成分及其性质进行分析 鉴定 K 9 免疫电泳操作步骤 10 结果复杂 经验判断 可不生成沉淀线 浓度太高或太低 或沉淀线重合 技术评价 11 1 Ig量及单克隆性与沉淀线致密 度关系 2 Ig量与
5、抗体槽距离之间的关系 抗原抗体最适比关系 结查分析 K 12 血清蛋白的分析 如多发性骨 髓瘤 r 球蛋白缺乏症 应用 13 2 对流免疫电泳 定义 定向加速度的免疫双扩散技术 K 对流免疫电泳示意图 在pH8 0的缓冲液中 蛋白质抗 原带负电荷向正极泳动 而抗 体Ig由于分子量大 暴露的极 性基团较少 在离子琼脂中泳 动缓慢 同时受电渗作用的影 响向负极泳动 在抗原抗体相遇 的最适比例处形成乳白色沉淀 线 电渗 指在电场中液体对于一个固定介质的相对移动 14 出现沉淀线 洗涤 染 色 分析结果 对流免疫电泳操作步骤 制琼脂板 打孔 加样 电泳 AbAg 15 高电渗为特点 但电渗过强会使蛋白
6、质向阴极移 动 K 对流免疫电泳简便 快速 敏感度较高 抗原 抗体比例要求严格 抗原或抗体PI相近或迁移率非常接近 不宜做对 流免疫电泳 技术评价 16 可用于乙肝病人血清鉴定 甲 胎蛋白的测定 但近年多以ELISA 替代 应用 17 定义 加速度的单向扩散 J 3 火箭免疫电泳 火箭免疫电泳示意图 标准曲线测定样本 含有抗体的琼指 基本原理 琼脂凝胶中的抗体 不发生移动 K 样品孔中的 抗原向正极泳动 随抗原含量 的逐渐减少 抗原泳动的基底 区越来越窄 抗原抗体分子复 合物形成的沉淀线逐渐变窄 形成一个状如火箭的不溶性免 疫复合物沉淀峰 18 制备制备含抗体的琼脂板含抗体的琼脂板 K K 打
7、孔打孔 加样加样 电泳电泳 出现火箭形沉淀线出现火箭形沉淀线 洗涤 染色 分析结果洗涤 染色 分析结果 火箭免疫电泳操作步骤 19 峰高峰高 浓度标准浓度标准 曲线曲线 以不同稀 释度标准抗原泳动后形成的沉淀峰为纵坐标 抗 原浓度为横坐标 绘制标准曲线 根据样品的沉 淀峰长度即可计算出待测抗原的含量 唯一的定量方法 K 火箭免疫电泳的定量测定火箭免疫电泳的定量测定 20 l 电渗小 2 电泳终点时间较难掌握 3 开启小电流后再加样 否则形 成宽底峰 4 IgG电泳应先将其甲酰化 使只 带负电荷 火箭电泳操作时应注意以下几点 21 PH 8 6时 分析蛋白质抗原带 有负电荷 免球测定应先甲酰化
8、以增加 其净负电荷量 技术评价 22 大多数蛋白质均可用这一方法 进行测定 但目前已被敏感度高 特异性好的ELISA等方法代替 应用 23 基本原理 将抗血清直接加于电泳后 蛋白质区带表面 抗原与 对应抗体直接发生沉淀反 应 未结合的游离抗原或 抗体洗去 则出现被结合 而固定的某种蛋白 5 免疫固定电泳 K immunofixation electrophoresis IFE IgA 型MM 24 海伦娜免疫固定仪 25 免疫固定电泳最常用于M蛋白的鉴定 鉴定方法 先将患者血清在琼脂上等作区带电 泳 之后 加抗血清 依次加抗IgG 抗IgA 抗 IgM 抗K轻链和抗L轻链 必要时还可加抗Fab
9、 抗Fc等特殊抗血清 作用后 洗涤 染色后分析 固定的M蛋白成分 该方法可用于各种蛋白水平的定性检测 应用 26 1 电泳载体的选择 与电泳要求的具体条件如摩擦力 电渗 及 电泳物质分子量大小等决定 2 凝胶打孔及处理 用打孔器在凝胶板上打孔后 要用琼脂溶液 封底 以免样品渗漏 四 凝胶免疫电泳的技术要点 27 3 加样 加样时琼脂板应先通上微弱电流 以免样品 过多自由扩散 4 选择抗原与抗体比例 适当比例抗原抗体反应生成大的免疫复合物 选择抗原和抗体的比例尽量减少前后带现象的 发生 28 5 检测方法 如果沉淀线理想 通过肉眼观察即可定性 在一些定量测定中 往往辅助以下方法来提高 检测的敏感
10、度 1 染色 2 光密度测定法 3 放射性自显影 29 6 干燥与保存 1 除盐及游离蛋白质后 干 燥 2 保存 将染色片浸泡在 5 l0 甘油中30min 保存效果更好 30 五 免疫增殖性疾病及免疫检测 重点 临床和检验特点 免疫增殖病 淋巴细胞异常增殖 免疫球蛋白异常增生性疾病 浆细胞异常增殖 良性增殖 常多克隆增殖 恶性增殖 常单克隆增殖 31 免疫球蛋白恶性增生性疾病的免疫损伤 1 免疫球蛋白合成异常 血液粘稠增加 2 正常体液免疫抑制 3 免疫球蛋白或其片段可以沉积于组织 激活细胞免 疫或补体系统 造成器官损伤 4 浆细胞瘤的浸润性生长 溶骨性病变 32 多发性骨髓瘤 MM 特点
11、I 介绍几种免疫球蛋白异常增生性疾病 贫血 肾功损害 免疫功能障碍 骨痛 高粘血症 临床特点 检查特点 正常的免疫球蛋白含量明显降低 血M蛋白或尿本周蛋白 骨髓发现大量浆细胞 溶骨性损害 33 检测方法 火箭和对流用于检测有无抗体 检测 MM效果不好 K 1 血清蛋白电泳 M蛋白 2 尿本周氏蛋白检测 3 免疫检测方法免疫电泳 免疫固定电泳 免疫球蛋白及轻 重链定量 34 免疫固定电泳 免疫电泳 免疫球蛋白定量 35 巨球蛋白血症 特点 好发于老年男性 血粘滞过高综合征 临床特点 检查特点 其它免疫球蛋白常在正常范围 血IgM蛋白 淋巴结 肝和脾肿大 36 重链病 重链的不同可分为 型 型 型 特点 贫血 细菌感染 淋巴结肿大 临床特点 检查特点 正常的免疫球蛋白含量可降低 重链 37 轻链病 型 型 此型预后差 特点 发热 肾功能损害 临床特点 检查特点 免疫球蛋白水平可降低或正常 轻链 贫血 溶骨性损害 38 良性单克隆免疫球蛋白增殖病 特点 无明显临床症状 临床特点 检查特点 其它免疫球蛋白常在正常范围 有M蛋白 但其并不呈进行性增加 39 小结 免疫电泳 对流免疫电泳 火箭免疫电泳 和免疫固定电泳的定义 原理及技术要点 几种免疫增殖性疾病的临床特 点和检验特点 40 41 42
