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1、北京海思特临床检验所有限公司 2017 07 20 1 内 容 o MDS与克隆性 o 染色体异常与MDS的克隆性 o 基因突变与MDS的克隆性 o 基因芯片与基因突变的联合应用 2 1 MDS疾病的概述 是起源于造血干细胞的一组异质性髓系克隆性疾病 特点是髓系细胞发育 异常 表现为无效造血 难治性血细胞减少 高风险向急性髓系白血病 AML 转化 核出芽 核 碎 裂 核间桥 n特点 n骨髓增生异常综合征分类 WHO2016版 关键词 病态造血 单系或多系 环形铁粒幼细胞 4 n 病态造血 MDS的病态造血细胞主要来 自于恶性克隆 病态造血可以反映MDS的本 质 但不是MDS所特有 疾病诊断的根
2、本 证明病态造 血是MDS克隆所致 5 MDS 是不明原因导致的癌性造血克隆逐渐扩增 引起的正常造血衰竭 性疾病 癌性克隆出现 某种原因 癌性克隆获增殖优势 癌性细胞 正常血细胞 抑制正常造血 癌性克隆 继续扩 增 dysplasia pancytopenia Hb WBC PLT normalMDSAML 正常 2 MDS疾病的本质 6 n 染色体与克隆性 至少2个细胞有同样的染色体增加或结构重排 或者至少3个细胞有同样 的染色体丢失 方可确认存在1个异常克隆 人类细胞遗传学国际命名体制 ISCN1995 血液肿瘤患者的染色体畸变常呈克隆性 此种克隆性明确提示疾病的 恶性本质 3 MDS的单
3、克隆细胞群的标记 7 N Engl J Med 2012 366 1090 8 o基因突变的积累会导致正常细胞获得恶性克隆 o从MDS阶段到sAML阶段分子克隆是一个演化的过程 分子克隆的 种类逐渐增加 各克隆的所占比例也发生较大变化 n 基因突变与克隆性 4 MDS的单克隆性分析的重要性 维也纳诊断标准中明确提出染色体 基因突变克隆性分 析的重要性 内 容 o MDS与克隆性 o 染色体异常与MDS的克隆性 o 基因突变与MDS的克隆性 o 基因芯片与基因突变的联合应用 10 1 MDS患者的染色体异常 40 60 MDS患者具有非随机的染色体异常 MDS中染色体异常及比例 WH0 2008
4、 2 染色体的诊断价值 难治性血细胞减少 遗传 学异常 与MDS特异性较高的染色体 核型包括 7 7q 5 5q 13 13q 11q 12p t 12p 及平衡性易位如 t 11 16 t 3 21 t 1 3 t 2 11 等 del 20q 8 Y 当形态学证据不充足时 可以诊断为MDS不能推测为MDS 当形态学证据不充足时 3 染色体的预后价值 n 染色体核型分 析至少20个骨 髓细胞的中期 分裂象 阳性 检出率低 骨髓增生异常综合征中国专家共 识 2014版 4 染色体检测手段的要求 FISH对染色体检测阳性率可以达到50 但 是探针数量有限 骨髓增生异常综合征中国专家共识 2014
5、版 nFISH检测 n 基因芯片技术 骨髓增生异常综合征中国专家共识 2014版 16 o单亲二倍体 是指一对同源染色体全部来自父亲或母亲 UPD分为遗传性和获 得性两种 获得性UPD在癌症的发展过程起重要的作用 o20 的MDS患者表现为获得性UPD 获得性UPD可导致受累基因的纯合突变 在MDS患者中通常表现为MDS相关基因的纯合突变 17 5 全基因组芯片 n 原理 18 Millions of locations available on each GeneChip array The probes are all between 25 and 49 bp in length Micr
6、oarray 探针包埋在固相支撑物上 提供丰富的生物信息 寡核苷酸探针客服了分辨率的 局限 The DNA probes在25 80 bp长度间 在1 28 1 28cm上能够包 含650w个生物探针 在检测CNV方面数据质量 极高 可以发展成为能够检测非 CNV的突变 e g LOH UPD and IBD区域 可以用于genotyping 19 基因芯片可检测染色体扩增 缺失 单亲二倍体 20 芯片检测结果提示 21 n 基因芯片在临床应用的意义 基因芯片可提高染色体异常检出率 MDS染色体异常的阳性检出率为 78 其中20 阳性异常为UPD 而染色体核型 FISH的检出率为59 22 B
7、lood 2011 Tiu 4552 60 不同的预后分组的MDS患者结合基因芯片结果后 OS存在较大差异 n 芯片临床应用时机 oMDS的诊断与鉴别诊断 特异性诊断价值的克隆性证据寻找 如 7 7q 5 5q 13 13q 11q 等 以辅助MDS的诊断 与其他非克隆性疾病的鉴别诊断 AA IRP等 oMDS的预后判断 对染色体异常的全面检出 更能契合IPSS R预后系统的分层评估 o作为细胞遗传学的补充手段 提高染色体异常检出率 单 亲二倍体 缺失 扩增更高的检出率 24 内 容 o MDS与克隆性 o 染色体异常与MDS的克隆性 o 基因突变与MDS的克隆性 o 基因芯片与基因突变的联合
8、应用 25 o1987年首次报道MDS患者存在基因突变 基因突变里程碑式的进展 26 p 2011年报道 核型正常的MDS患者 近50 存在基因突变 27 p 2014年 MDS中国版专家共识将常见的几种基因突变纳入其中 28 29 基因突变克隆性分析的关键 p 确定基因突变的致病性 是克隆造血的关键证据 MDS相 关基因 突变检 测 突 变 位 点 无 临 床 意 义 有 临 床 意 义 多 态 性 非 多 态 性 胚 系 突 变 获 得 性 突 变 会导致克隆性 造血的点突变 确定胚系突变的临床 意义 患者病因确定 调 整治疗方案 造血干细胞移植供 者筛查 患者的遗传咨询 及定期随访 30
9、 单核苷酸多态性 SNP 与非多态性位点突变的鉴别 SNP指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性 它是人类可遗传的变异中最常见的一种 胚系突变与获得性突变的鉴别 胚系突变 基因突变通过卵子和 精子传递 导致几乎所有的胚 胎细胞都存在相同的突变 这种突变可以代代相传 获得性突变 后天由于某种原因导致的体细胞发生的突变 p 几个概念 助于理解何为致病性 31 基因突变克隆性分析的临床应用 1 提示克隆性造血的存在 为诊断提供参考依据 2017版NCCN指南明确提出 基因突变 可提示MDS的克隆性造血的存在 对于无法确诊的MDS患者 基因突变的克隆性分析 可以提供辅助标准指标 3
10、2 2 辅助疾病亚类的鉴别 MDS伴单系病态造血 MDS伴多系病态造血 MDS伴环形铁粒幼细胞 SF3B1基因突变 可作为 MDS疾病亚型的分类 33 3 1 SF3B1基因 oSF3B1 基因定位于2q33 是RNA剪切因子 o常见的剪切因子有SF3B1 SRSF2 U2AF1 ZRSR2 等 这类基因的突 变存在互相排斥性 即在同一例患者中几乎只出现其中1个基因突变 Yoshida et al Nature 2011 34 3 2 SF3B1与环形铁粒幼细胞的相关性 Blood 2013 121 260 269 血红素合成 的基因表达 异常 线粒体 铁代谢 异常 在MDS或MDS MPN患
11、者中 存在SF3B1基因突变时 出现伴有环形铁粒幼细胞的 可能性为97 7 而SF3B1基因不突变时 97 8 的可能性不会出现环形铁粒幼细胞 3 1 SF3B1基因突变 MDS RS RARS Rui Cui et al Leukemia Research 2012 36 1428 若存在SF3B1基因突变 提示预后较好 3 辅助疾病的预后判断 36 Rafael Bejar haematologica 2014 99 6 在IPSS R预后分级为极低危 低危 中危的患者 若存在 TP53 EZH2 ETV6 RUNX1 ASXL1突变中的任何一种 预后较差 3 2 影响危险分级 TP53
12、EZH2 ETV6 RUNX1 ASXL1 37 携带的基因突变数量和种类越多 疾病的预后分层越差 进展越 快 转化为AML的几率越高 3 3基因突变数量影响预后 Haematologica 2014 Jun 99 6 956 964 38 oMDS的病人同时存在许多表观遗传控制基因的突变 如 ASXL1 DNMT3A EZH2 IDH1 IDH2和TET2等 o通过对这些基因突变的检测可进一步预测MDS是否会 对去甲基化药物发生反应 4 临床指导用药 4 1去甲基化药物敏感性预测 39 骨髓增生异常综合征诊断与治疗专家共识 2012版 4 2 TP53与来那度胺 诊断与鉴别 诊断 预后判断用
13、药指导 环状铁粒幼细 胞 与SF3B1 MDS 基因突 变分析套餐 IPSS R MDS 基因突变分析套 餐 去甲基化药 物 ASXL1 DNMT3A EZH2 IDH1 IDH2和 TET2 来那度胺治 疗 TP53 基因突变 免疫制剂治 疗 ATG 环孢素 HLA DR15 基因检测 基因突变小结 5 临床应用小结 41 内 容 o MDS与克隆性 o 染色体异常与MDS的克隆性 o 基因突变与MDS的克隆性 o 基因芯片与基因突变的联合应用 42 联合二者综合分析 基因突变 基因芯片 某些基因位点突变分析 染色体的高分辨分析 可检出染 色体扩增 缺失 单亲二倍体 杂 合性缺失 二个方法联
14、 合 可全面 捕获MDS 克隆证据 提高检出率 备注 MDS需多指标综合诊断 此种联合也必须建立在骨髓细胞学 骨髓 活检 常规染色体分析等方面检测的基础之上 对61例MDS CMML患者联合评估 材料和方法 韩国8个医院收集经WHO分类的61位MDS CMML 患者 将地西他滨用于一线治疗方案 染色体核型 分析 IPSS分组 治疗前基因芯 片检测 临床跟踪 分析 患者信息 基因芯片检出结 果联合EZH2 TP53基因突变对 OS EFS的影响 47 1 MDS克隆性基因突变套餐 20种 目的 寻找MDS病态造血的克隆性证据 辅助疾病亚型分类及 预后判断 适用人群 疑似MDS患者 指标权威参考
15、覆盖WHO指南 NCCN指南所提到的基因突变 指标 覆盖深度 检出率大于10 TET2 DNMT3A ASXL1 SF3B1 SRSF2 U2AF1 TP53 RUNX1 检出率在5 10 EZH2 ZRSR2 STAG2 NRAS 检出率在2 5 BCOR SETBP1 IDH1 IDH2 ETV6 JAK2 CBL KRAS MDS相 关基因 突变检 测 突 变 位 点 无 临 床 意 义 有 临 床 意 义 多 态 性 非 多 态 性 胚 系 突 变 获 得 性 突 变 胚系与获得性鉴别 髓系肿瘤中常见 的胚系突变 RUNX1 ETV6 等 可导致克隆 性造血 已明确的获得性 突变导致M
16、DS的 克隆性造血 2 髓系肿瘤高频基因突变 30种 目的 AML MDS MPN MDS等疾病的高频基因突变检测 适用人群 疑似MDS患者 AML患者 覆盖广度 MDS检出率大于10 TET2 DNMT3A ASXL1 SF3B1 SRSF2 U2AF1 TP53 RUNX1 AML检出率在10 IDH1 IDH2 FLT3 ITD NPM1 KIT CEBPA DNMT3A NRAS WT1 JMML相关基因 KRAS NRAS CBL PTPN11 NF1 SETBP1 CMML相关基因 TET2 SRSF2 ASXL1 其他 BCOR BCORL1 STAG2 PIGA PHF6 JAK2 EZH2 ETV6 ZRSR2 3 送检标本要求 项目标本要求 MDS克隆性基因突变套 餐 20种 同时采集检测样 本和验证样本 检测样本 骨髓3 5mL EDTA 抗凝 验证样本 口腔黏膜 头发 指甲 髓系肿瘤高频基因突变 30种 骨髓3 5mL EDTA抗凝 1 口腔黏膜 采样前30分钟内禁止吃东西 喝水或任何饮料 采样时 用力刮取两侧脸颊内口腔黏膜 左右脸颊 都要刮 每侧10次 共刮取
