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1、1毛细管区带电泳分离和检测利多卡因方法的研究作者；马汉祥，刘 红，吕 淞，高改莉，施伟忠，李 锋【摘要 】 目的 建立毛细管电泳分离和检测利多卡因的方法。方法 毛细管区带电泳分离利多卡因，电泳分离条件：30mmol/L NaH2PO4-H3PO4（ pH=5.0）缓冲液。先采用压力（20psi ）进水5s，随后电动进样（8kV，5s ） ，检测波长 200nm，运行电压30kV，温度 20，运行时间 5min。结果 在 0.112.5g/ml 范围内呈良好的线性关系和重现性（R2=0.9998，n=5 ） ，回收率96.80%105.8%，日内及日间精密度(RSD)均小于 6%。方法的检测限
2、10ng/ml。结论 本方法简便、快速、灵敏，为利多卡因的定量测定提供了新的、更为理想的方法学手段。【关键词】 毛细管区带电泳；分离；利多卡因【Abstract】 Objective To establish capillary zone electrophoresis method for the determination and separation of lidocaine.Methods Determination and separation of lidocaine by capillary zone electrophoresis (CZE) and electrophores
3、is conditions were as following：buffer was 30mmol/L NaH2PO4-H3PO4 solution (pH=5.0)，the working 2voltage at 30kV，temperature at 20，UV detection at 200nm，sampling injected 5 seconds with voltage at 8kV.Results The established method had a good linearity and precision within the concentration range of
4、 0.112.5g/ml(R2=0.9998). The range of recovery was 96.8%105.8%，and relative standard deviations of inter-day and intra-day were less than 6%. The detection limit was 10ng/ml.ConclusionThis assay was simple，rapid and sensitive. It is a new and ideal analytical means for the determination of lidocaine
5、.【Key words】 CZE； lidocaine； separation利多卡因属于酰胺类中效局麻药，具有起效快、弥散广、穿透性强、安全范围较大、无扩张血管作用及对组织无刺激等特点，可用于多种形式的局部麻醉，也是抗心律失常的常用药物之一。硬膜外阻滞用量为 400mg，其血药浓度达 24g/ml。当血药浓度超过5g/ml 时出现中毒症状，超过 7g/ml 时出现惊厥1 ，因此其血药浓度监测具有重要的临床意义。以往多采用酶免疫分析法2 、气相和高效液相色谱法3 。但成本高，操作繁琐，干扰多，色谱柱易受污染等。而毛细管电泳（Capillary electrophoresis， CE）是 20
6、世纪 90 年代以来迅速发展起来的一种新型的分离检测手段，3具有分离效率高、分析速度快、样品用量少、运行成本低、预处理简单以及应用范围广等技术优势，已在生物医药领域获得了许多成功的应用4 。本研究结合利多卡因的结构特点，选用毛细管区带电泳（CZE）分离模式，优化缓冲体系、pH 值、检测波长、分离电压和温度等条件，建立了适合利多卡因定量测定的 CZE 方法。1 材料与方法1.1 仪器与试剂 毛细管电泳仪：美国 Beckman 公司P/ACE5000 型配有紫外吸收（UV） 、二极管阵列（PDA）和Beckman 工作站；毛细管为涂层石英毛细管，57cm75m（河北永年光纤厂） ，有效长度 50c
7、m；PHS-3B 精密 pH 计（上海精密科学仪器有限公司） ；SB2200T 超声波洗涤装置（必能超声上海有限公司） 。利多卡因（针剂，0.1g/5ml，山东兖州益健制药有限公司批号：0407182） ；利多卡因标准品（宁夏医学院附属医院制剂中心 批号：030408） 。 NaH2PO4、H3PO4 、HCI 和 NaOH 等试剂均为国产分析纯，水为自制双蒸去离子水。1.2 样品溶液和缓冲液的制备41.2.1 标准品及样品溶液的配制 准确称取利多卡因标准品10mg，用双蒸去离子水溶解至 100ml。分别配制浓度为12.5、6.25、2.5、0.5 和 0.1g/ml 标准溶液，用双蒸去离子配
8、制不同浓度的利多卡因样品。用 0.45m 微孔过滤器过滤，超声波脱气 5min 后备用。1.2.2 运行缓冲液的配制 精密称取 NaH2PO4 适量，加水制成1540mmol/L NaH2PO4。用 H3PO4 和 NaOH 将其 pH 值分别调为 4.4、4.6、4.8、5.0 和 5.2 低温贮备。1.3 实验条件的选择 开机后，以 1mol/L HCI、0.1mol/L NaOH 溶液、水及 NaH2PO4-H3PO4 缓冲液冲洗毛细管各3min，两次进样之间以 0.1mol/L NaOH 溶液、水及缓冲液冲洗毛细管 3min 后进样：先采用压力（20psi）进水 5s，随后电动进样（8
9、kV，5s） ，运行时间 5min。以迁移时间、峰高、峰面积的重现性和峰形的对称性作为分离效果的判断依据，综合上述参数优化实验条件。1.3.1 缓冲体系 根据利多卡因的理化性质及缓冲液的选择原则，选择 NaH2PO4-H3PO4 为实验的缓冲体系。再以 1.2.2 项配制的缓冲液选择最佳运行缓冲液浓度和 pH 值。51.3.2 检测波长及进样条件 根据利多卡因的理化性质，以 PDA检测器进行扫描。在 200nm 有较大吸收峰。因此，确定采用200nm 作为 UV 检测波长；先采用压力（ 20psi）进水 5s，随后电动（8kV，5s ）进样。1.3.3 分离电压和温度 分别采用 15、18 、
10、20、23 、25、28 及30kV 作为分离电压，选择最佳分离电压；分别在柱温为 15 、18、20、22 、 25、28 及 30 ，选择最佳柱温。1.4 重现性和最低检测限 为确定上述分析条件下定量分析的精密度，考察利多卡因的相对迁移时间和校正峰面积的重现性。重复8 次进样，计算迁移时间的相对标准差（RSD）和校正峰面积的RSD。当电泳峰高与噪声比值（S/N）为 3 时， 计算利多卡因的最低检测限。1.5 回收率和精密度 以 12.5、2.5 、0.5g /ml 高中低 3 种浓度的利多卡因分别进行 CZE 分析，以校正峰面积计算得出的利多卡因浓度与加入的利多卡因量之比计算回收率；同法，
11、1d 内平行测定 5次，测得日内精密度；连续 5d，每日测定高中低 3 种浓度各 1 次，测得日间精密度。2 实验结果62.1 在所选择的实验条件下，利多卡因获得满意的分离。以药物浓度为横坐标（C） ，校正峰面积为纵坐标（）进行线形回归。在0.112.5g /ml 范围内线形关系良好：C=0.0004193+0.0627， R2=0.9998。优化条件下的利多卡因（12.5g/ml）CZE 图谱见图 1。图 1 利多卡因区带电泳图谱2.2 实验条件的选择 30mmol/L NaH2PO4-H3PO4(pH=5.0)为最佳缓冲液，见表 1，表 2。表 1 不同浓度的缓冲液对利多卡因分离度的影响注
12、：电泳分离条件：NaH2PO4-H3PO4 (pH=5.0)缓冲液；检测波长 200nm；电压 30kV；柱温：20表 2 pH 对利多卡因分离度的影响7注：电泳分离条件：缓冲液为 30mmol/L NaH2PO4-H3PO4；检测波长 200nm；电压 30kV；柱温：20最佳检测波长 200nm、运行电压 30kV、实验温度 20 。见表3，表 4。表 3 工作电压对利多卡因分离度的影响注：电泳分离条件：缓冲液为 30mmol/L NaH2PO4-H3PO4(pH=5.0)；检测波长 200nm；柱温：20表 4 柱温对利多卡因分离度的影响8注：电泳分离条件：缓冲液为 30mmol/L N
13、aH2PO4-H3PO4(pH=5.0)；检测波长 200nm；电压 30kV2.3 回收率和精密度 平均回收率为 96.8%105.8% ；日内、日间 RSD 小于 6%。见表 5。表 5 加样回收率和精密度测定结果2.4 重现性和最低检测限 相对迁移时间的 RSD 小于 4%，相对校正峰面积 RSD 小于 6%。利多卡因的最低检测限为 10ng/ml。3 讨论本研究主要探讨毛细管电泳条件的选择和优化。毛细管区带电泳法中，不同的缓冲体系、缓冲液 pH 值、温度、电压、检测波长以及进样方式都会影响样品的保留时间、吸收度、重复性和峰形5，6 。缓冲体系不合适，分离效果会很差，甚至导致分离失败。缓
14、冲液9的 pH 直接影响待分离样品表面的电荷量及毛细管表面的电荷密度5 。本研究结果显示 30mmol/L NaH2PO4-H3PO4 缓冲体系在pH=5.0 为最佳。电压是影响径向电场的主要因素之一，可以改变样品的分离效率和速度。采用高电压，将使分离时间大大缩短，从理论上讲将提高分辨率6 。但电压太高将使电泳过程中产生的焦耳热无法及时散发，引起分辨率降低，峰形变宽等现象。电压太低，分离时间会延长并且会影响分离效果。本实验结果提示在 28kV 和30kV 时，峰形和吸收度无差别，但 30kV 时，分离时间较短。温度的改变将影响电极缓冲液的粘度，当温度升高时，粘度降低，从而使电流升高，电渗流增大
15、，分离时间缩短。但温度太高，会使毛细管中产生的焦耳热难以及时散发，引起峰形变宽，影响分离效果。温度过低会使分离时间延长，本实验结果 20最佳。本实验毛细管区带电泳分离利多卡因的优化条件为：缓冲液为30mmol/L NaH2PO4-H3PO4（pH=5.0） ；先采用压力（20psi）进水 5s，随后电动进样（8kV， 5s） ；检测波长 200nm；运行电压 30kV；柱温 20。本研究应用毛细管区带电泳法分离并定量分析利多卡因，为临床开展利多卡因血药浓度监测奠定了基础。【参考文献】1 庄心良，曾因明，陈伯鉴现代麻醉学第三版北京：人民10卫生出版社，2003，951-960.2 Pape BE
16、， Whiting R， Parker KM， et al. Enzyme immunoassay and gas-liquid chromatography compared for determination of lidocaine in serum. Clin Chem，1978， 24：2020-2022.3 Swezey CB， Ponzo JL. Liquid chromatographic determination of lidocaine in serum. Clin Biochem，1984 ，17 ：230-232.4 王义明，罗国安，魏伟，等毛细管电泳在医药领域中的应用色谱，1997，15：494-498.5 罗国安，王义明毛细管电泳的原理及应用色谱，1995，13 ： 437-407.6 谢莹，林梅，张正行，等提高毛细管电泳重现性的几种方
