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1、2010级本科分子生物学实验设计 案例 患儿 男性 3岁 因面色苍白伴血尿1天入院 1天前食用新 鲜蚕豆后 今日出现恶心 呕吐 排尿呈酱油样色 面色苍白 据家长反映 患者的姐姐也曾发生过类似情况 体格检查 体温38 脉搏150次 分 呼吸40次 分 血压 80 60mmHg 呼吸急促 神清 萎靡 面色苍白 皮肤及巩膜 黄染 体型较同龄人瘦小 心 肺未及异常 肝 脾未触及 双 肾区无叩击痛 神经系统检查未及异常 实验室检查 红细胞 1 98 1012 L 血红蛋白53g L 血清总胆红素85 5 mol L 结 合胆红素13 7 mol L 未结合胆红素71 8 mol L 尿蛋白 潜血 尿胆红
2、素 尿胆素原 尿液镜下未见红细胞 阅读下列案例 根据要求回答问题并设计实验进一步明确诊断 1 一 根据上述患儿的临床 表现和实验室检查 初步 判断患儿是何种疾病 蚕豆病 2 恶心 呕吐 面色苍白 皮肤及巩膜黄染 红细胞 1 98 1012 L 血红蛋白53g L 血清总胆红素85 5 mol L 尿蛋白 尿胆红素 尿胆素原 尿液镜下未见红细胞 黄疸 红细胞膜不完整 已破裂 红细胞含量少 含量明显增加 血红蛋白量减少 排尿呈酱油样色 游离胆红素增加 溶血性黄疸 蚕豆病 肠肝循环增多 3 蚕豆病简介 n蚕豆病是一种6 磷酸葡萄糖脱氢酶 G 6 PD 缺 乏所导致的疾病 表现为在遗传性葡萄糖 6 磷
3、酸 脱氢酶 G 6 PD 缺陷的情况下 食用新鲜蚕豆 后突然发生的急性血管内溶血 易发人群 n多见于儿童 男性患者约占90 以上 4 临床表现 n早期有恶寒 微热 头昏 倦怠无力 食欲缺乏 腹痛 继之出现黄疸 贫血 血红蛋白尿 尿 呈酱油色 此后体温升高 倦怠乏力加重 可持 续3日左右 与溶血性贫血出现的同时 出现呕吐 腹泻和腹痛加剧 肝脏肿大 肝功能异常 约 50 患者脾大 严重病例可见昏迷 惊厥和急性 肾衰竭 若急救不及时常于1 2日内死亡 5 二 设计实验进一步 明确诊断 红细胞葡萄糖 6 磷酸脱氢酶活 性测定 紫外法 6 一 实验器材和试剂 1 实验器材 恒温水循环紫外分光光度计 可见
4、分光光度计 离心机 2 试剂 1 0 5mol L Tris HCl MgCl2缓冲溶液 pH8 0 称取 Tris12 1g MgCl2 6H2O 4 06g 加入160mL蒸馏水溶解 用 HCl调pH至8 0 然后加入蒸馏水至200mL 2 2 mmol L烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 NADP 称取 NADP 21 3mg 溶于10mL蒸馏水中 4 可保存20天左右 3 6mmol L葡萄糖 6 磷酸二钠 G6P Na2 称取21 5mg G6P Na2 2H2O 溶于10mL蒸馏水中 4 可保存20天左右 7 4 溶血剂 取巯基乙醇0 1mL 10 EDTA 2 0mL 6mmol L N
5、ADP 0 4mL 加蒸馏水至总 体积200mL 5 血红蛋白氧化剂 Drabkin试剂 称取 K3Fe CN 6 0 2g KCN 0 052g NaHCO3 1 0g 加蒸馏水至1000mL 置棕色瓶内避光保存 可 保存20天 6 0 9 NaCl ACD抗凝剂 8 二 实验操作流程 n1 洗涤红细胞 取静脉血2 0mL 放入含 0 4mLACD抗凝剂的试管中 混匀 吸取0 2mL 抗凝血放入试管中 加入4mL预冷的生理盐水 轻轻摇匀 2500r min离心5min 倾去上清 重复 三次 n2 溶血液的制备 向红细胞沉淀中加入溶血剂 2 0mL 震荡1min 4 放置10min以上 9 3
6、 NADPH的测定 取石英比色杯两只 标为 测定 及 空白 按下表操作 试剂体积 蒸馏水 uL 0 5mol L Tris HCl MgCl2缓冲溶液 uL 6mmol L G6P Na2 uL 2mmol L NADP uL 2040 300 300 300 混匀后放入带恒温水循环 25 的紫外分光 光度计中 预热10min 然后在 测定 中加入溶血液60uL 空白 中加 入溶血剂60uL 混匀 10 以 空白 调 0 1min后开始测340nm吸光度 A340 每2min纪录吸光度一次 至10min止 比较每2minA值的变化 情况 若相近则表明酶促反应平稳 以10minA值的变化 A34
7、0 计算NADPH的产量 4 溶血液中血红蛋白含量的测定 取试管一支 按下表操作 试剂体积 Drabkin mL 溶血液 mL 0 3 3 0 混匀 室温放置15min 以Drabkin试剂调零 读取 540nm的吸光度 A540 11 三 注意事项 n1 洗涤红细胞时禁止剧烈震荡 避免溶血 n2 测定NADPH时读取吸光度的时间要准确 12 四 结果分析 n1 NADPH产量的计算 NADPH在340nm处 其每微摩尔 的吸光系数 为6 220 故10min内NADPH的产量计 算公式为 nNADPH产量 mol n2 血红蛋白含量的计算 血红蛋白氧化为高铁血红蛋白以 后 在540nm处 其
8、毫摩尔吸光细数 为44 故溶血 液中血红蛋白的含量计算公式为 n血红蛋白含量 mmol 13 3 G6PD比活性 U g Hb 的计算 G6PD比活性单位 U g Hb 参考范围 正常值 大于2 8U gHb 14 三 从生化代谢解释 患儿的临床表现和实 验室检查结果 15 n红细胞膜的破坏 n胆色素代谢异常 16 红细胞膜的破坏 n葡萄糖磷酸戊糖途径 葡萄糖 6 磷酸葡萄糖 5 磷酸核糖 NADPH H 磷酸化 5 磷酸核糖 磷酸戊糖途径 NADPH H 5 磷酸核糖 NADPH H 5 磷酸核糖 NADPH H 5 磷酸核糖 NADPH H NADPH维持GSH 谷胱甘肽 的正常含量和还原
9、状态 G6PD 6 磷酸葡萄糖脱氢酶 起关键作用 17 n还原型谷胱甘肽 体内重要的抗氧化剂 保护红细胞膜蛋白的完整性 红细胞膜的破坏 单核吞噬细 胞识别吞噬 血红蛋白 珠蛋白 氧化破坏红细胞氧化破坏红细胞 单核吞噬细 胞识别吞噬 氧化破坏红细胞 血红蛋白 单核吞噬细 胞识别吞噬 氧化破坏红细胞 珠蛋白 血红蛋白 单核吞噬细 胞识别吞噬 氧化破坏红细胞 血红素 珠蛋白 血红蛋白 单核吞噬细 胞识别吞噬 氧化破坏红细胞 18 单核吞噬细 胞识别吞噬 血红蛋白 珠蛋白 氧化破坏红细胞氧化破坏红细胞 单核吞噬细 胞识别吞噬 红细胞 血红蛋白 单核吞噬细 胞识别吞噬 红细胞 珠蛋白 血红蛋白 单核吞噬
10、细 胞识别吞噬 红细胞 血红素 珠蛋白 血红蛋白 单核吞噬细 胞识别吞噬 红细胞 胆色素代谢异常 血红素 运送到肝 与血清蛋白结合游离胆红素 结合胆红素 排出体外 进入肠道 胆素原胆素 肠肝循环 胆红素 扩散进入组织 组织黄染 黄疸 排尿呈酱油样色 溶血性贫血 面色苍白 19 说明 n17 20为一个版本 n22 31为另一个版本 n 参考一下看哪个你比较容易理解然后就用哪 个 20 实验室检查 检查项目检查值正常值 红细胞 1 98 1012 L 4 0 5 0 1012 L 血红蛋白 53g L 120 160g L 血清总胆红素 85 5 mol L 3 4 17 1 mol L 结合胆
11、红素 13 7 mol L 总量的20 未结合胆红素 71 8 mol L 总量的80 21 G6PD 磷酸戊糖途径 NADPH 磷酸戊糖 维持谷胱甘肽的还原性 核酸生物合成原料 红细胞 90 95 糖酵解通路 2 3 二磷酸甘油酸旁路 5 10 磷酸戊糖途径NADPH 唯一 22 谷胱甘肽阻止氧化血红蛋白 从而保护红细胞膜的 完整性 如若缺乏 此时的红细胞易于破裂 Hb 具有携氧能力 MHb 高铁血红蛋白 Fe3 不具有携氧能力 NADPH 高铁血红蛋白还原酶 GSH MHb Hb 23 胆红素 铁卟啉类化合物的降解产物 80 以上来自衰老红细胞破坏所释放的血红蛋白的分解 自由通过生物膜产生
12、毒性作用 血红蛋白 珠蛋白 AA再利用 血红素 胆红素 24 胆红素分类 项目游离胆红素结合胆红素 别名间接胆红素 血胆红素 直接胆红素 肝胆红素 与葡萄糖醛酸结合未结合结合 与重氮试剂反应慢或间接反应迅速直接反应 水中溶解度小大 经肾随尿排出不能能 通透细胞膜对脑的 毒性作用 大无 25 G6PD缺乏 NADPH严重缺乏 谷胱甘肽难以保持还原状态NADPH 高铁血红蛋白还原酶活性 低 红细胞膜完整性破坏 红细胞裂解 血红蛋白大量溢出 胆红素生成量增加 Hb大量氧化成MHb Hb含量减少 26 黄疸 n皮肤 巩膜及黏膜等组织黄染 n恶心 呕吐 n全身无力 n面色苍白 27 溶血性黄疸 由于红细
13、胞的大量破坏 在单核 吞噬细胞系统产生胆红素 过多 超过了肝细胞的摄取 转化和排泄胆红素的能力 造 成血液中未结合胆红素浓度显著增高所致 高未结合胆红素血症 由于肝对胆红素的摄取 转化 排泄增多 过多的胆红 素进入胆道系统 肠肝循环增多 使得 尿中的尿素原和 尿胆素含量增多 粪胆素与粪胆原也增加 28 溶血性黄疸 大量红细胞破裂 血中未结合胆红素增加肠肝循环增多 大量血红蛋白溢出尿蛋白 潜血 尿胆红素 尿胆素原 尿液镜下未见红细胞 恶心 呕吐 面色苍白 排尿呈酱油样色 粪胆素原 29 项目检查值正常值 体温38 37 5 脉搏150次 分80次 分 呼吸40次 分20次 分 血压80 60mm
14、Hg120 90mmHg 红细胞大量破裂 30 四 要想探讨该病发生的分 子基础 可以用哪些技术检 测什么目的基因 选答 基因结构分析法 31 我组讨论认为 要想探讨该病发生的分子 基础 需要对目的基因进行基因结构分 析 即DNA序列检测 D N A 序 列 测 定 方 法 直接法 间接法 对于未知片段 或片段过长 用几种方法 RFLP PCR RFLP SSCP 来粗略的估计待分析基因 的一级结构是否与对照基因相同 双脱氧末端终止法 Sanger法 化学裂解法 Maxam Gilbert法 DNA的自动化测序 D N A 序 列 测 定 方 法 32 DNA链的方向是5 3 交替的磷酸基团和
15、戊 糖构成了DNA的骨架 backbone 33 构成DNA 脱氧核糖 deoxyribose 双脱氧末端终止法 Sanger法 nSanger法是根据双脱氧核苷 三磷酸 ddNTP 在DNA合成 过程中不能形成3 5 磷 酸二酯键而导致链延伸终止 的原理 利用四种ddNTP代 替部分脱氧核苷酸 dNTP 作为底物进行DNA合成 从而获得在不同部位终止反 应的大小不同的DNA链 结 合高分辨率变性聚丙烯凝胶 电泳分离 就可以对DNA序 列进行分析 34 TAATCTGCAGGC3 5 加入引物 32P dATP dGTP dTTP DNA聚合酶 3 TAATCTGCAGGC5 5 3 prim
16、er ddGTPddATPddTTPddCTP ATTAG ATTAGACG A ATTA ATTAGA AT ATT ATTAGACGT ATTAGAC ATTAGACGTC ATTAGACGTCC ATTAGACGTCCG 35 ATTAG ATTAGACG A ATTA ATTAGA ATT ATTAGACGT ATTAGACGTC ATTAGACGTCC ATATTAGAC 聚丙烯酰胺凝胶电泳 GATC G C C T G C A G A T T A 3 5 ATTAGACGTCCG 36 五 患者体型瘦小与该 病症是否有关 为什么 选答 患者体型瘦小与该病症有关 37 蚕豆病是因为体内缺乏G6PD G6PD主要影响 体内的磷酸戊糖途径 该途径主要生成两种重要的 物质即5 磷酸核糖和NADPH 5 磷酸核糖影响 1 核酸的合成 2 体内己糖和戊糖的代谢 3 3 7碳原子糖类物质的相互转化 38 NADPH影响 1 体内以NADPH作为供氢体合成多种活性物质如胆固醇 脂肪酸 和一些非必需氨基酸 2 NADPH可作为羟化酶的辅酶 参与体内生物转化作用 3 NADPH参与吞噬细胞的杀
