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1、Chapter 7Chapter 7 食品卫生细菌的检测技术食品卫生细菌的检测技术 学习目标 掌握学习食品中菌落总数检测程序和方法 掌握学习食品中大肠菌群检测程序和方法 掌握食品中菌落总数和大肠菌群检测结果 的报告方式 主要内容 食品中菌落总数的测定 S1 食品中大肠菌群的测定 S2 S1 菌落总数的测定 一 菌落总数 是指食品检样经过处理 在一定条件下培 养后 所得1mL g 或1cm2面积检样中所含 菌落的总数 以菌落形成单位 colony forming unit CFU 表示 二 菌落总数测定的意义 1 判定食品被细菌污染的程度及卫生质量 2 预测食品存用的期限长短 3 了解细菌在食品
2、中的繁殖动态 三 菌落总数测定的方法 平板倾注法 平板表面涂布法 平板表面点滴法 四 平板倾注法测定菌落总数 检验步骤 程序 检样 稀释处理 做平板 培养 菌落计数 报告结果 一 样品稀释及做平板 1m l 1m l 1m l 1m l 1 10 1 100 0 1 10 0 1 1000 01m l 1m l 1m l 加入46 营养琼脂 12 15ml 25g ml样 品 生理盐 水 Note 检样从开始稀释到倾注最后一个平 皿所用时间不宜超过20min 以防止细菌 有所死亡或繁殖 二 培养 普通食品 37 48h 倒放平板 清凉饮料 调味品 糕点 酒类 37 24h 水产品 30 48h
3、 三 计数和报告 到达规定培养时间 应立即计数 如果不能立 即计数 应将平板放置于0 4 但不得超过 24h 1 单个菌做一个菌落计 2 呈链状生长的菌落之间无任何明显界限 作 为一个菌落计 如存在有几条不同来源的链 则 每条链均应按一个菌落计算 3 如片状菌落不到平板一半 而另一半又分布 均匀 则可以半个平板的菌落数乘2代表全平板 的菌落数 1 菌落的选择 2 平板菌落计数的选择 1 选取菌落数在30 300之间的平板 SN标 准要求为25 250个菌落 若有二个稀释度均 在30 300之间时 比值小于或等于2取平均数 比值大于2则其较小数字 2 如均大于300 则取最高稀释度的平均菌落 数
4、乘以稀释倍数报告 3 如均小于30 则以最低稀释度的平均菌落 数乘稀释倍数报告 4 如菌落数有的大于300 有的又小于30 不在30 300之间 以最接近300或30的平均菌 落数乘以稀释倍数报告 5 如所有稀释度均无菌落生长 则应按小于1 乘以最低稀释倍数报告 3 菌落数的报告 菌落数在1 100时 按实有数字报告 1 如大于100时 则报告前面两位有效数字 第三位数按四舍五入计算 2 固体检样以克 g 为单位报告 3 液体检样以毫升 ml 为单位报告 4 表面涂擦则以平方厘米 cm2 报告 四 检验注意事项 1 对照平板出现几个菌落时 要追加对照平板 2 吸管进出瓶子或试管时 吸管口不得触
5、及瓶口 管口的外围部分 3 吸管插入试样液内的深度不得小于2 5cm 调整 时要使管尖与容器内壁紧贴 4 进行稀释时 吸管口不得与稀释液接触 5 检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不 宜超过20min 6 稀释倍数愈高菌落数愈少 稀释倍数愈低菌落数 愈多 如出现逆反现象 不可作为检样计数报 告的依据 食品卫生细菌的检测技术 三 嗜热菌 芽孢 计数 一 仪器用具 冰箱 培养箱 高压灭菌锅 恒温水浴锅 托盘天平 可调式电炉 吸管 广口瓶 三角瓶 平皿 试管等 二 培养基和试剂 1 葡萄糖 胰蛋白胨琼脂 同上 2 亚硫酸盐琼脂 将胰蛋白胨10g 硫酸钠1g 硫乙醇酸 钠5g溶解于1000mL蒸
6、馏水中 加入5 柠酸酸铁10mL 加入琼脂 加热煮沸 使琼脂溶化 pH自然 分装烧瓶 121 高压灭菌20min 3 去氧肝汤 食品卫生细菌的检测技术 三 操作步骤 将检样25g加入到盛有225mL无菌水的三角烧瓶内 迅速 煮沸5min以杀死细菌繁殖体及耐热性低的芽孢 然后将烧瓶 浸于冷水中冷却 1 平酸菌计数 在5只无菌培养皿中各注入2mL样液 用葡萄糖 胰蛋白琼 脂做倾注平板 凝固后在50 55 培养48 72h 计算5个 平板上菌落的平均数 平酸菌在葡萄糖 胰蛋白琼脂平板上的菌落为圆形 直径2 5mm 具不透明的中心及黄色晕 晕很狭 产酸弱的细菌 其菌落周围不存在 或不易观察到 平板从培
7、养箱内取出后 应立即进行计数 因为黄色会很快消退 如在培养48h后不 易辨别是否产酸 则可培养到72h 食品卫生细菌的检测技术 2 不产生硫化氢的嗜热性厌氧菌检验 将已处理过的样品加入等量新制备的去氧肝汤 总量为 20mL 于试管中 以2 无菌琼脂封顶 先加热到50 55 然后在55 中培养72h 当有气体生成 琼脂塞破裂 气味似干酪 时 可以认为有嗜热性厌氧菌存在 3 产生硫化氢的嗜热性厌氧菌计数 将已处理过的样品加入到已熔化的亚硫酸盐琼脂试管中 总量为20mL 共6份 将试管浸于冷水中 培养基固 化后 加热到50 55 然后在55 培养48h 能产生硫 化氢的细菌会在亚硫酸盐琼脂管内形成特
8、征性的黑小片 因 为硫化氢被转化为硫化铁等硫化物 计算黑小片数目 某 些嗜热菌不生成硫化氢 但代之以生成强大还原性氢 使全 部培养基变黑色 食品卫生细菌的检测技术 四 厌氧菌计数 一 仪器用具 冰箱 培养箱 高压灭菌锅 恒温水浴锅 托盘天平 可调式电炉 吸管 广口瓶 三角瓶 平皿 试管等 二 培养基和试剂 硫乙醇酸盐琼脂的配制 将胰消化干酪素15g L 胱氨 酸0 5g 酵母浸膏5g 葡萄糖5g 氯化钠2 5g 硫乙醇酸 钠0 5g 刃天青0 001g溶解于1000mL蒸馏水中 加入琼 脂15g 加热煮沸 使琼脂溶化 调pH为7 0 7 1 分装 烧瓶 试管中 121 高压灭菌15min 食品
9、卫生细菌的检测技术 三 操作步骤 1 倾注平板 将检样稀释液lmL 注入于已溶化并晾至45 50 的硫 乙醇酸钠琼脂管内 摇匀 倾注平板 2 叠一层琼脂 冷凝后 在其上再叠一层3 无菌琼脂 3 培养 计数 凝固后 在37 培养96h 然后取出进行菌落计数 食品卫生细菌的检测技术 五 革兰氏阴性菌计数 一 仪器用具 冰箱 培养箱 高压灭菌锅 恒温水浴锅 托盘天平 可调式电炉 吸管 广口瓶 三角瓶 平皿 试管等 二 培养基和试剂 VRB琼脂的制备 将胰蛋白胨7g 酵母浸膏5g 氯化钠 5g 乳糖10g 胆盐1 5 g溶解于1000mL蒸馏水中 加入 琼脂15g 加热煮沸 使琼脂溶化 再加入中性红0
10、 03g 结晶紫0 002g 再煮沸2min pH7 4 0 2 三 操作步骤 1 制备营养琼脂平板 倾注15 20mL营养琼脂于无菌培养皿中 凝固后 在 37 烘去表面水分 食品卫生细菌的检测技术 2 涂布 吸注检样稀释液0 1mL于平板上 共2份 立即用无菌L 形玻棒涂开 放置片刻 3 层叠VRB琼脂 层叠已溶化并凉到45 50 的VRB琼脂3 4mL 4 培养 计数 在30 培养48h后 计数菌落 食品卫生细菌的检测技术 S2 大肠菌群的测定 一 大肠菌群 1 什么是大肠菌群 指一群需氧及兼性厌氧 在37 能分 解乳糖产酸 产气的革兰氏染色阴性 无芽胞杆菌 2 大肠菌群的组成 大肠埃希氏
11、菌发属 柠檬酸杆菌属 产 气克雷伯氏菌属和阴沟肠杆菌 属代表种致病性 埃希氏菌属 Escherichia 大肠埃希氏菌 E coli 肠道外感染 急性腹泻 志贺氏菌属 Shigella 痢疾志贺氏菌 Sh dysenteriae 细菌性痢疾 爱德华氏菌属 Edwardsiella 迟纯爱德华氏菌 E tarda 蛇类等血动物的正常肠道寄居菌 偶见于健康人或腹泻 者粪便内 沙门氏菌属 Salmonella 伤寒沙门氏菌 S typhi 肠热症 急性肠炎 败血症 枸橼酸杆菌属 Citrobacter 弗劳地氏枸橼酸杆菌 C freundii 条件致病菌 引起继发性感染 克雷伯氏菌属 Klebsie
12、lla 肺炎克雷伯氏菌 K pneumoniae 肺炎 泌尿系 创伤感染 败血症等 阴沟肠杆菌 Enterobacter 产气杆菌 E aerogenes 很少引起原发性感染 哈夫尼亚菌属 Hafnia 蜂窝啥夫尼亚菌 H alvei 对人无致病性 沙雷氏菌属 Serrati 粘质沙雷氏菌 S marcescens 条件致病菌 引起泌尿系 呼吸道及创伤感染 变形杆菌属 Proteus 普通变形杆菌 P vulgaris 食物中毒 泌尿系 呼吸道感染 等 耶尔森氏菌属 Yersinia 鼠疫耶尔森氏菌 Y pestis 鼠疫 欧文氏菌属 Erwinia 草原居民欧文氏菌 E herbicola
13、植物寄生菌 曾从人体肠道及化脓扁桃体中分离到 1 粪便污染的指标菌 大肠菌群或大肠杆菌 2 以大肠菌群作为粪便指标菌原因 1 在粪便中数量最大 2 在外环境中存活的时间与致病菌大体相同 3 检测方法简便容易 二 大肠菌群的测定意义 3 大肠菌群的测定意义 1 判断食品中否受到粪便污染 2 有利于控制肠道传染病的发生和流行 3 有利于控制食品在生产加工 运输 保存等过程中的卫生状况 三 大肠菌群的生物学特性 1 形态与染色 革兰氏染色阴性 无芽胞杆 菌 2 发酵乳糖产酸产气 3 培养特性 在 琼脂上的典型菌落 呈 深紫黑色或中心深紫色 圆形 稍凸起 边缘整齐 表面光滑 常有金属光泽 在麦康凯琼脂
14、上的典型菌落 呈桃红色或中心 桃红 圆形 扁平 光滑湿润 EMB平板照片及原理 麦康凯琼脂平板 Age of culture is 24 h 大肠杆菌 大肠菌群选择性显色培养基 COLI ID 用于在37 下对食品中大肠菌群和大肠杆菌进行检测 计数及大肠杆菌的鉴定 本培养基含有两种显色物质 可以直接识别大肠菌群 coliforms 和鉴定大肠杆菌 Escherichia coli 而不需附加任何试剂 菌落颜色 玫瑰红 蓝色 透明 葡萄糖苷酶 半乳糖苷酶 大肠杆菌 其它大肠菌群 其它革兰氏阴性菌 半乳糖苷酶 大肠菌群存在 半乳糖苷酶 大肠菌群存在 葡萄糖苷酶 大肠杆菌存在 葡萄糖苷酶 无大肠菌群
15、存在 大肠杆菌平板菌落照片 肠杆菌扫描电镜照片 食品卫生细菌的检测技术 一 乳糖发酵法 一 原理 由于大肠菌群指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关 的细菌 即 需氧及兼性厌氧 在37 能分解乳糖产酸产气 的革兰氏阴性无芽胞杆菌 因此大肠菌群的检测一般都是按 照它的定义进行的 二 设备和材料 恒温恒湿培养箱 36 1 冰箱 0 4 显微 镜 天平 高压灭菌锅 恒温水浴 44 5 0 5 均质 器或乳钵 酒精灯 试管架 平皿 直径为90mm 试管 吸管 广口瓶或三角烧瓶 500mL 玻璃珠 直径约 5mm 载玻片 盖玻片等 食品卫生细菌的检测技术 三 培养基和试剂 1 乳糖胆盐发酵管 成分 蛋白
16、胨 20g 胆盐 猪或牛或羊 5g 乳糖10g 0 04 溴甲酚 紫水溶液25mL 蒸馏水1000 mL 制法 将蛋白胨 胆盐 乳糖溶于水中 校正pH7 4 加入指示剂溴甲 酚紫 分装于试管 并倒放入一个小试管 杜拉姆发酵管 在121 高压 灭菌15min 备用 2 伊红美蓝琼脂平板 EMB 成分 乳糖10g 蛋白胨10g 磷酸氢二钾2g 琼脂17g 2 伊红Y溶 液20mL 0 65 美蓝溶液10mL 蒸馏水1000 mL 制法 先将琼脂加到900mL蒸馏水中 加热溶解 然后加入磷酸氢二钾 蛋白胨 混匀 使之溶解 再以蒸馏水补足至1000mL 校正pH值为7 2 7 4 分装于烧瓶内 121 15min高压灭菌备用 临用时加入乳糖并 加热融化琼脂 冷至60 左右以无菌手续加入灭菌的指示剂伊红Y溶液和美 蓝溶液 摇匀 倾注平皿 备用 食品卫生细菌的检测技术 3 乳糖发酵管 成分 蛋白胨20g 乳糖10g 0 04 溴甲酚紫水溶液 25mL 蒸馏水1000 mL 制法 将蛋白胨 乳糖溶于水中 校正pH7 4 加入指 示剂溴甲酚紫 分装于试管 并倒放入一个小试管 杜拉姆 发酵管 在121
