D-二聚体检测与运用

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1、D 二聚体的检测 与应用 2012 11 1 临漳县医院检验科 马玉海 内容提要 一 D 二聚体的产生及技术现状 二 D 二聚体检测试剂的要求 三 标准化问题 四 Innovance D Dimer 试剂 五 D 二聚体检测的临床应用 六 D 二聚体检测结果的解释 D Dimer检测技术的发展史 1972年 Gaffney首先提出 D Dimer检测 可作为监测 凝血性疾病的 有用的工具 1983年 Rylatt等首先报道了用单克隆抗体 DD 3B6 22 检测D Dimer 乳胶凝集法 当时被誉为 金标准 90年代 ELISA分析法 乳胶增强型免疫分析法等 90年代末到本世纪初 免疫比浊法在

2、凝血仪上实现了 自动化检测 但D 二聚体片段异源性的问题被忽略了 凝血系统统 内源性凝血外源性凝血 凝血酶原凝血酶 FXIIIFXIIIa 纤溶酶原 纤溶酶 纤维蛋白单体 纤维蛋白原 交联纤维蛋白 FDP X Y D E等 碎片 X 等碎片 DD DXD DD E YXD 等复合物 一 D 二聚体的产生 纤纤溶系统统 纤纤溶溶凝固凝固 所检测的D二聚体片段 D 二聚体检测的技术现状 制备单克隆抗体 针对的只是某类型D 二聚体 病理过程中可产生多种类型D 二聚体 由于不同检 测试剂只测定其中某种类型 而非降解片段的全部 因此各类试剂在对同一标本进行测定时 其敏感性 显著不同 目前 30种检测方法

3、 20余 种单克隆抗体 被应用于临 床 不同试剂间差异非常显著 无统一的国际标准 D 二聚体检验方法的演变 低敏方法导致许多病理状态无法及时反映 急性肺血栓栓塞症诊断治疗专家共识 中华内科杂 志2010年1月 推荐 高敏感度的方法 国际上目前已经开始逐渐推动高敏方法 原方法敏感度低 阳性率低 新方法敏感度高 阳性率高 临床 与既往的使用经验不符 二 D 二聚体检测试剂选择 高度敏感性和NPV 几乎 无假阴性 有明确的阈值 cutoff值 l 适用于24小时作常规分析 l 可用于门急诊标本分析 l 自动化检测 l 操作步骤简易 l 快速的报告时间 l 定量检测 有标准 质控物 l 经济 检测试剂

4、盒 目前市场上用于检测D 二聚体的试剂品种有很多种 大体上可分为两种情况 一种是以欧美产品为代表 主要用于DVT PE排除筛查 特点 灵敏度高 检测范围相对较窄 另一种是以日本产品为代表 主要是用于DIC诊断 特点 灵敏度相对较低 检测范围较宽 VTE DVT PE exclusion DIC D Dimer 无统一的国际标准 目前有超过30种检测方法和20多种单抗被使用 存在两种报告单位 D dimer DDU 和纤维蛋白原当量 FEU 抗体对D二聚体不同片段有不同的亲和力 不同的试剂有不同的干扰情况 三 标准化问题 美国临床实验室标准化协会 CLSI H59 P推荐指南 D二聚体试剂标准

5、中国国家标准 讨论稿 4 2 阴性预测值 结合临床诊断的验前概率进行D 二聚体检测 其阴性预测值应不 低于95 4 3 测试范围 涵盖制造商提供的用于排除诊断的临界值的1 2到4倍的临床标本 测定值 4 4 线性 D 二聚体试剂在测试范围内 线性相关系数应大于0 98 4 5 精密度 4 5 1 重复性 用正常质控血浆同日内重复测试所得结果的变异系数 CV 不超 过15 用高值异常质控血浆同日内重复测试所得结果的变异系 数 CV 不超过10 4 7 报告方式 D 二聚体的报告单位通常包括纤维蛋白原等量单位 FEU 和D 二聚体单位 DDU 两种形式 FEU是将D 二聚体的量用 降解前纤维蛋白原

6、分子的量来表达 因此 用FEU表达的D 二聚 体的量相当于用DDU表达的1 7倍 在D 二聚体报告方式中还包 括ng mL ug mL和mg L等形式 通常应该直接采用制造商提 供的单位 不建议进行形式和量纲的转换 四 Innovance D Dimer检测试剂 已通过过美国FDA验证验证 FDA510K 明确可用于静脉栓 塞性疾病的排除 其 阈值为0 5mg L FEU 已得到EHA ICTH 和日本病理学会接受 2010年在中国成功注册 检测原理 全自动乳胶增强免疫比浊度法 新一代单克隆抗体8D3 检测系统 Sysmex CA 7000 system Sysmex CA 1500 syst

7、em Sysmex CA 560 system CS series 检测试剂 抗体试剂 REAGENT 乳胶颗粒包被 低压冻干 需蒸馏水复溶 稀释液 DILUENT 液体 用于样本稀释 定标稀释 有缓冲液作用 添加剂 SUPPLEMENT 液体 用于封闭非特异性抗体 缓冲液 BUFFER 液体 使信号增强 含有聚合碳水化合物的缓冲液 定标品 与试剂批号匹配 有不同系统的靶值 冻干粉 人血浆为基质 所含D二聚体浓度大约为 4 4 mg L FEU 定标曲线有效期6个月以上 定标 范围 0 19 4 40 mg L FEU 或更宽 自动6点定标 定标有效期达6个月以上 样本 每测试 8 15 L

8、单次检测 检测范围 0 19 35 20 mg L FEU 样本结果高于定标曲线范围 仪器自动稀释 样本高于检测范围 可用Innovance D DIMER Diluent再 进行检测 质控品 CONTROL 1 冻干粉 正常范围 大约0 3mg L FEU 低于参考范围和CUTOFF值 CONTROL 2 冻干粉 异常范围 大约3mg L FEU 高于参考范围和CUTOFF值 试剂稳定性 Stability after preparation TemperatureReagentBufferSupplem DiluentCal Controls 2 to 8 C4 wks4 wks4 wks

9、4 wks 5 days 18 C8 wks8 wks8 wks8 wks 2 wks 15 to 25 C 4 hrs6 hrs On board stability BCS BCS XP BCT Sysmex CA 7000 Sysmex CA 1500 Sysmex CA 560 Reagents48 hrs48 hrs48 hrs24 hrs8 hrs Calibrator4 hrs4 hrs4 hrs4 hrs4 hrs Control8 hrs8 hrs8 hrs8 hrs8 hrs 分析性能 抗原过剩 D dimer 在500 mg L FEU以下 和FDP在2000 mg L

10、FEU以 下都没有抗原过剩 是cutoff值0 5mg L FEU的1000倍 分析灵敏度 BCS BCS XP BCT Sysmex CA 7000 Sysmex CA 1500 Sysmex CA 560 Analytical sensitivity mg L FEU 0 0700 0750 0320 0360 068 对潜在干扰物质不敏感 主要通过SUPPLEMENT来阻断非特异性抗体 抗干扰能力 BCS BCS XP BCT Sysmex CA 7000 Sysmex CA 1500 Sysmex CA 560 类风湿因子 IU mL 13301330133013301330 甘油三脂

11、 mg dL 600600400600400 血红蛋白 mg dL 200200200100200 胆红素 mg dL 6015601512 总蛋白 g L 7575757575 肝素 IU mL 88888 Innovance D DIMER 的参考区间及cutoff值 正常人群的百分之90分位数 0 55 mg L FEU Cutoff值 0 5mg L FEU 没有检测系统差异 略高于CUTOFF值 85 的正常人群的D二聚体低于 0 50 mg L FEU 均值和中位数均低于CUTOFF值 1 在不同地区建立样本采集点 2 收集门诊怀疑有DVT和PE的病人样本 至少300人 3 病人选

12、择 采用Wells 的验前概率 Pretest Probability PTP 评估规则和影像学检查 并对阴性病人进行为期三个月的 随访 以最终确诊是否患有DVT或PE 4 剔除预防或抗凝治疗的病人和孕妇 5 对所有选中的疑似患者同时进行D 二聚体检测和影像学检查 6 对D 二聚体检测结果作受试者工作特征 ROC 曲线并确定 cutoff值 国外通常采用以下步骤建立cutoff值 FDA验证结果 FDA510K NCutoff mg L FEU N false negative NPV LCL Sensitivity LCL Specificity LCL Innovance D DIMER

13、Sysmex CA 700014250 50299 5 98 799 4 98 038 3 35 4 Sysmex CA 150014250 50299 5 98 799 4 98 039 3 36 9 Sysmex CA 56014250 50299 5 98 699 4 98 037 8 35 4 Comparison Assays VIDAS D Dimer Exclusion 14250 500399 3 98 399 0 97 438 1 35 7 Stratus CS DDMR11280 450299 4 98 499 2 97 539 7 37 0 LCL Lower 95 co

14、nfidence limit 结果报告 结果报告的形式和单位按厂家推荐 不要对单 位做任何转换 不是所有的D 二聚体检测的阈值 cutoff值 都是500ug L FEU或0 5mg L FEU 报参考区间还是报cutoff值 Innovance D Dimer与D Dimer Plus的比较 Innovance DDD Dimer Plus FDA认证已通过 510K 没通过用于排除 单抗8D3DD5 报告单位mg L FEUmg L DDU Cutoff值0 5mg L FEU0 13mg L DDU 参考区间0 55mg L FEU0 0 246mg L DDU 线性范围0 19 4 4

15、mg L FEU0 1 2 1mg L DDU 检测范围0 19 35mg L FEU0 1 16mg L DDU 开瓶后稳定性2 8 4周 18 8周 2 8 2天 室温5天 18 2周 抗类风湿因子 肝素1330IU mL 8IU mL98IU mL 2 5IU mL Hook Effect含量在500 mg L FEU以 下 无 有 为为什么要更换换 给临给临床一个解释释 1 高灵敏度检测D 二聚体 是检测本身的要求 也是临床 评估和诊断疾病的要求 2 Innovance DD通过FDA认证 并明确用于DVT和PE排除 已得到EHA ICTH和日本病理学会接受 3 选用新的单抗8D3 其

16、灵敏度 稳定性 抗干扰能力更优 4 Cutoff值的设定更科学合理 符合行业内认可 标准 5 结果报告单位 使用mg L FEU 符合目前国际趋势 6 线性范围更宽 便于临床动态观察 五 D 二聚体检测的临床应用 深静脉血栓 肺栓塞 早期排除诊断 DIC的早期诊断和动态监测 外科手术术后的血栓监测监测 妊高症 先兆子痫的监测 恶恶性肿肿瘤 白血病 早期识别识别 血栓监测监测 肝脏脏疾病 重症肝炎 肝硬化 肾脏疾病 肾病综合征 肾移植术后 溶栓治疗评估及血栓复发的监测 心血管疾病病情评估 心力衰竭 房颤 旁路手术 脑梗死鉴别和治疗监测 1 DVT和PE的排除 D 二聚体检测最大的临床价值是 用于排除DVT和PE 循证医学证实其 VTE和PE的排除性诊断价值 目前临床结合验前概率 pretest probability PTP 同 时检测患者D 二聚体浓度 来排除DVT和PE 当PTP评估 为低 中风险 D 二聚体检测cutoff值为阴性 0 5mg L FEU 即可排除DVT和PE 无需再做进一步的影像学检查 血管造影虽是诊断DVT和PE的 金标准 但其检查费用 相对较高 且有侵入性损伤