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1、1桃儿七提取物对人乳腺癌 MCF【关键词】 乳腺癌Effects of Taoerqi extract on proliferation and apoptosis of human breast carcinoma cell line MCF7【Abstract】 AIM: To investigate the effects and related mechanism of Taoerqi on the proliferation inhibition and onset of apoptosis in breast carcinoma cell line MCF7. METHODS: A
2、ntiproliferative effect of Taoerqi extract against MCF7 was tested by MTT assay, morphologic changes of MCF7 were observed by inverted microscope, electron microscope and HE staining, and cell apoptosis percentage and cell cycle phase distribution of MCF7 were measured by flow cytometric assay. The
3、expressions of proliferation and apoptosisassociated proteins were determined by immunocytochemical method. RESULTS: A timedependent and dosedependent proliferation inhibition was demonstrated in Taoerqi extract. With the Taoerqi extract treatment of 1, 2 and 3 mg/L for 72 h, the inhibitory rate was
4、 43.0%, 54.9%, 78.5% respectively. The characteristic 2morphological changes of apoptosis were observed in cells after treated by 2 mg/L of Taoerqi, and many multinucleate giant cells were also found. Taoerqi induced a G2/M cell cycle arrest and the apoptosis was time and dosedependent. With the tre
5、atment of 2 mg/L Taoerqi for 48 h, the protein expressions of PCNA and Bcl2 decreased from (154.780.16) and (85.560.09) to (78.460.15) and (40.430.07) (P0.01), while p21WAF1/CIP1 and cMyc increased from (92.320.12) and (114.480.14) to (125.540.09) and (156.520.08) (P0.01). CONCLUSION: The timedepend
6、ent and dosedependent proliferation inhibitory effect of Taoerqi extract on breast cancer cells appears to be caused by the upregulation of p21WAF1/CIP1 expression, downregulation of PCNA expression, and the apoptosis is related to the downregulation of antiapoptotic protein Bcl2 and the upregulatio
7、n of cMyc protein. G2/M arrest is also associated with apoptosis.【Keywords】 Taoerqi; breast neoplasm; human breast carcinoma cell lines MCF7; apoptosis【摘要】 目的:研究桃儿七对人乳腺癌 MCF7细胞增殖抑制3和促进凋亡的作用,探讨其抗癌作用的机制. 方法: 应用 MTT法检测桃儿七提取物对人乳腺癌 MCF7细胞的生长抑制作用，倒置显微镜、HE染色及电镜观察细胞形态学改变，FCM 分析细胞周期及凋亡率，免疫细胞化学法检测细胞增殖凋亡调控相关蛋白
8、的表达. 结果:桃儿七提取物可明显抑制 MCF7细胞的增殖，1，2，3 mg/L桃儿七作用 72 h后，细胞生长抑制率分别为 43.0%，54.9% ，78.5%，抑制作用呈时间及浓度依赖性.形态学观察到用药后凋亡细胞典型的形态学特征，伴有多核细胞形成.FCM 分析发现桃儿七阻断 MCF7细胞生长于细胞周期的 G2/M期，凋亡诱导作用呈时间及浓度依赖性.免疫细胞化学结果显示，2 mg/L桃儿七作用 48 h后，PCNA，Bcl2蛋白表达分别由 154.780.16，85.560.09 降至78.460.15，40.430.07，P0.01 ；而 p21WAF1/CIP1和cMyc蛋白由 92.
9、320.12，114.480.14 增至125.540.09，156.520.08，P0.01. 结论:桃儿七提取物对人乳腺癌 MCF7细胞的生长有明显的呈时间及浓度依赖性的抑制作用,G2/M期阻滞并诱导凋亡. 该作用与 p21WAF1/CIP1表达增加及PCNA表达降低有关，通过下调 Bcl2和上调 cMyc表达诱导乳腺癌细胞凋亡.【关键词】 桃儿七;乳腺癌;人乳腺癌细胞系 MCF7;凋亡0引言4藏药桃儿七又名小叶莲，藏药音译奥色塞，习用果实. 宗玉英等1发现桃儿七果实 900 mL/L乙醇提取物对肿瘤细胞抑制率为 75%,目前对于其抗肿瘤作用机制仍不很清楚. 我们对桃儿七根900 mL/L
10、乙醇提取物抑制乳腺癌细胞增殖及其诱导凋亡的作用机制进行研究如下.1材料和方法1.1材料乳癌细胞 MCF7由第四军医大学分子生物学室惠赠. 小牛血清，RPMI 1640培养基（Gibco 公司）; 噻唑蓝（MTT ，上海生工生物制品公司）;二甲基亚砜（DMSO）;p21WAF1/CIP1，cMyc，Bcl2 ，PCNA 鼠抗 mAb，SABC 及 DAB试剂盒（博士德公司）. 酶标仪（奥地利 Tecan）;相差倒置显微镜（Olympus CK4032RPC）;流式细胞仪（美国 Coulter Elite Esp型）;投射电镜（JEM2000EX 日本）. 取桃儿七根粗粉 100 g，以石油醚（3
11、060）浸提至无色，药渣再以 900 mL/L乙醇浸提至无色，乙醇回收溶剂，减压蒸馏获得浸膏，真空低温干燥，制得样品.样品先以少量 DMSO溶解，然后用双重蒸馏水稀释配制为 20 mg/mL的原液，用 0.22 m孔径滤膜过滤除菌后-20避光保存，临用前5再以 RPMI 1640完全培养基稀释配成不同药物浓度， DMSO在溶液中最大浓度小于 0.05%.1.2方法1.2.1细胞生长状态取对数生长期细胞常规消化接种于 96孔培养板（3103 个/孔） ，每孔 200 L，培养 24 h后弃去培养液，随机分为 5组(每组 n=8)，实验组加入含不同浓度桃儿七根乙醇提取物的 RPMI 1640完全培
12、养基 200 L，终浓度为（1，2，3 mg/L） ；阴性对照组加等量 RPMI 1640培养液；阳性对照组为顺铂（PDD ） 3 mg/L.分别于加药后 24， 48和 72 h加入 MTT (5 g/L) 20 L继续培养 4 h，弃培养液，每孔加 150 L DMSO，设置空白对照，振荡混匀 10 min,上酶标仪检测 A值，检测波长 490 nm，参考波长 640 nm.抑制率(%)=（1-实验组 A/对照组 A）100. 倒置显微镜动态观察细胞形态变化.取对数生长期细胞，调整细胞密度接种于置有载玻片的 6孔板培养皿，细胞贴壁后弃上清，用药组加入含 2 mg/L桃儿七的 RPMI 16
13、40的培养液共孵育，同时设对照组，48 h后行常规 HE检查. 再将 6105经 2 mg/L桃儿七作用后 24 h及 48 h的 MCF7细胞浸入 4冰冷的 40 g/L戊二醛固定 2 h，用探针剥离细胞团块，移入小瓶，常规电镜脱水，包埋，双铅染色，制备超薄切片，电子染色，透射电镜观察细胞超微结构.61.2.2细胞周期及凋亡取对数生长期细胞，调整细胞密度接种于 50 mL培养瓶(3105 个/瓶)，24 h后实验组加入含不同浓度桃儿七根乙醇提取物的培养液，对照组以等量 RPMI 1640代替样品，常规培养，分别于加药后 24，48 h常规消化，10 mmol/L PBS洗涤离心两次，取 11
14、06个细胞，70 mL/L冷乙醇固定过夜，再用PBS洗去固定液，加碘化丙啶(PI) 染色液 1 mL(含 0.25 g/L RNase A，20 mg/L PI)，置于 4 冰箱 30 min后上流式细胞仪检测 DNA含量，每组共测 1104个细胞.同时取 1106个细胞重悬于预冷的结合缓冲液，调整细胞数为 1109/L，加入 5 L Annexin VFITC和 5 L PI到 490 L细胞悬液中，4 避光孵育 10 min，流式细胞仪检测荧光强度，每组共测 1104个细胞.1.2.3免疫组化取对数生长期细胞，调整细胞密度接种于置有载玻片 24孔板的培养皿，实验组加入含 2 mg/L浓度桃
15、儿七根 90 mL/L乙醇提取物，对照组加等量 1640培养液，常规培养，于加药后 48 h终止培养，取出爬有细胞的玻片，10 mmol/L PBS冲洗 3次，950 mL/L乙醇固定 15 min，染色步骤严格按 SABC，DAB 试剂盒说明书操作，以 PBS代替一抗作阴性对照，检测Bcl2， cMyc，PCNA 及 p21WAF1/CIP1蛋白表达.染色结果判断：MCF7细胞核或( 和)胞质呈棕褐色为阳性，高倍视野下随机计数 5个视野细胞总数，计数其中的阳性细胞，算出阳性率,并用病理图像分析软件对蛋白表达进行半定量分析.7统计学方法：计量资料用 xs表示，计数资料用表示，采用 SPSS 1
16、0.0统计软件包作数据处理，分别采用秩相关分析，方差分析，t 检验.P0.05 表示差异有统计学意义 .2结果2.1桃儿七对 MCF7细胞生长的抑制作用对照组 MCF7细胞体外生长活跃，桃儿七对 MCF7细胞有明显的抑制作用， 1 mg/L 48 h出现细胞生长抑制，与对照组比较有统计学意义(P0.01) ，而 2和 3 mg/L 24 h出现极显著的差异（P0.01） ，并且随着作用时间的延长，细胞存活率逐渐下降，并呈时间、浓度依赖性,经秩相关分析 s=0.75，P0.05. 1，2 ，3 mg/L桃儿七作用 72 h后，细胞生长抑制率分别为 43.0%，54.9%，78.5%，阳性对照组 PDD 3 mg/L为 58.6%（Tab 1）. 表 1桃儿七对 MCF7细胞的影响（略）2.2肿瘤细胞形态学变化加桃儿七后细胞膜皱缩，细胞先变圆, 原来贴壁生长的细胞脱离生长面，呈悬浮状态，且随药物浓度增大及时间延长，
